Association des marqueurs inflammatoires de la constipation et de la translocation microbienne

Conception et population de l'étude

Patients et méthodes 2.1. Sélection des patients Deux cents patients hémodialysés sont recrutés. La constipation fonctionnelle sera diagnostiquée selon les critères de Rome IV. Les lésions organiques de la cavité abdominale et du plancher pelvien sont exclues chez tous les patients par une évaluation endoscopique (sigmoïdoscopie, coloscopie, gastroduodénoscopie), radiologique et échographique.

Cette étude sera réalisée conformément à la Déclaration d'Helsinki telle que révisée en 2008. Tous les patients donneront leur consentement éclairé écrit pour participer à l'étude. Tous les patients de la division rénale de l'hôpital Tungs Taichung Metroharbour ont été inclus de manière prospective et consécutive. Les critères d'inclusion sont

1. Hémodialyse depuis plus de 3 mois
2. Âge supérieur à 20 ans

Les critères d'exclusion sont un antécédent de maladie inflammatoire chronique, la présence d'une infection en cours, une maladie vasculaire du collagène ou un traitement immunomodulateur ou immunosuppresseur.

Mesures des cytokines inflammatoires, de l'étotaxine-1 et de l'amyloïde A

Les taux plasmatiques de MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A et calprotectine sont respectivement testés par un kit ELISA humain disponible dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant. Les taux sériques d'éotaxine1 humaine sont déterminés à l'aide d'un kit ELISA commercial (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) selon le protocole du fabricant. La procédure ELISA disponible dans le commerce est utilisée pour mesurer la concentration sérique d'amyloïde A dans le sérum,

Endotoxine et endotoxine Ig M ainsi qu'anticorps IgG core

L'endotoxine est mesurée dans le sérum par Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 de Lonza (catalogue # 50-647U)(EU/ml). Les échantillons de sérum ou de plasma sont dilués au rapport 1∶5 avec de l'eau de réactif LAL. Les anticorps core d'endotoxine IgG sont mesurés dans le plasma à l'aide d'un kit ELISA de Cell Sciences Inc (catalogue # HK504). Les unités sont exprimées en GMU/ml qui sont des unités médianes standard d'IgG basées sur des médianes de plages de 1000 adultes en bonne santé par le fabricant.

Détermination du phénotype mononucléaire CD14 et CD16

Le sang périphérique sera prélevé par ponction veineuse en utilisant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) comme anticoagulant. Pour l'analyse cytométrique, anticorps monoclonaux contre CD14 (isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué ; clone RMO52 ; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD16 (phycoérythrine (PE) conjugué ; clone 3G8 ; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD45 (phycoérythrine cyanine-5 (PC5); clone J33; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) et CD56 (clone IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) sont utilisés. En bref, 100 ul du sang total sont colorés avec des quantités saturantes des anticorps monoclonaux mentionnés ci-dessus et des témoins isotypiques correspondants. Après incubation pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité selon les recommandations du fabricant, OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) est ajouté pour lyser les GR et les échantillons sont fixés. Les cellules fixées sont analysées par cytométrie en flux dans les 6 heures.

La détermination de la distribution des sous-ensembles de leucocytes et de monocytes est effectuée à l'aide d'un cytomètre FC500 (Beckman Coulter) et le logiciel d'analyse CXP (version 2.2) est utilisé (Schroers et al., 2005). Les monocytes sont identifiés comme des cellules CD45 positives et CD56 négatives présentant un profil de diffusion spécifique vers l'avant et vers les côtés. Les monocytes sont ensuite bloqués dans un tracé de points SSC/CD, identifiant les monocytes comme des cellules CD86 avec des propriétés de dispersion des monocytes. Des sous-ensembles de monocytes CD14 avec et sans CD16 sont définis selon le profil d'expression de surface du récepteur CD14 des lipopolysaccharides et du CD16 (récepteur Fcgamma III). Un million de cellules sont analysées à partir de chaque échantillon, et le pourcentage de cellules mononucléaires CD16 positives (CD14+/CD16+ et CD14++/CD16+) et le nombre de cellules sur les monocytes totaux sont comparés à l'aide de microbilles fluorescentes (Flow-Count, Beckman Coulter). L'anticorps CD86 (clone HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) est utilisé dans cette étude.

Dosages sCD14, LBP, zonuline et I-FABP

Les marqueurs LBP et sCD14 sont utilisés pour surveiller la translocation microbienne tandis que la zonuline et l'I-FABP sont mesurées pour explorer la perméabilité intestinale : les taux plasmatiques de LBP sont mesurés à l'aide du kit ELISA Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP ELISA, conformément aux recommandations du fabricant. Le facteur de dilution est de 1:800. Le taux plasmatique de sCD14 est mesuré à l'aide du kit Human sCD14, selon les spécifications du fabricant. Le facteur de dilution est de 1:200. Les taux sériques de zonuline sont mesurés à l'aide du kit ELISA de zonuline humaine. Les taux plasmatiques d'I-FABP sont mesurés par kit ELISA selon les recommandations du fabricant.