Associazione dei marcatori di traslocazione microbica e infiammatoria della costipazione

Disegno dello studio e popolazione

Pazienti e metodi 2.1. Selezione dei pazienti Vengono reclutati 200 pazienti in emodialisi. La stitichezza funzionale sarà diagnosticata secondo i criteri di Roma IV. Lesioni organiche della cavità addominale e del pavimento pelvico sono escluse in tutti i pazienti mediante valutazione endoscopica (sigmoidoscopia, colonscopia, gastroduodenoscopia), radiologica ed ecografica.

Questo studio sarà condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki rivista nel 2008. Tutti i pazienti forniranno il consenso informato scritto a partecipare allo studio. Tutti i pazienti nella divisione renale del Tungs Taichung Metroharbour Hospital sono stati inclusi in modo prospettico e consecutivo. I criteri di inclusione sono

1. Emodialisi per più di 3 mesi
2. Età superiore a 20 anni

I criteri di esclusione sono una storia di malattia infiammatoria cronica, la presenza di infezione in corso, malattia vascolare del collagene o trattamento immunomodulante o immunosoppressivo.

Misurazioni di citochine infiammatorie, etotassina-1 e amiloide A

I livelli plasmatici di MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A e calprotectina sono testati rispettivamente con un kit ELISA umano disponibile in commercio, secondo le istruzioni del produttore. I livelli di eotassina1 sierica umana sono determinati utilizzando un kit ELISA commerciale (sistemi di ricerca e sviluppo, Minneapolis, MN, USA) secondo il protocollo del produttore. La procedura ELISA disponibile in commercio viene utilizzata per misurare la concentrazione sierica di amiloide A nel siero,

Endotossina ed endotossina Ig M e anticorpo core IgG

L'endotossina viene misurata nel siero mediante Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 di Lonza (catalogo n. 50-647U)(EU/ml). I campioni di siero o plasma vengono diluiti in rapporto 1∶5 con l'acqua del reagente LAL. Gli anticorpi core IgG dell'endotossina vengono misurati nel plasma utilizzando un kit ELISA di Cell Sciences Inc (catalogo n. HK504). Le unità sono espresse come GMU/ml che sono unità mediane standard IgG basate su mediane di intervalli di 1000 adulti sani dal produttore.

Determinazione del Fenotipo Mononucleare CD14 e CD16

Il sangue periferico sarà prelevato mediante prelievo venoso utilizzando acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) come anticoagulante. Per l'analisi citometrica, anticorpi monoclonali contro CD14 (isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugato; clone RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD16 (ficoeritrina (PE) coniugato; clone 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), Vengono utilizzati CD45 (ficoeritrina cianina-5 (PC5); clone J33; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) e CD56 (clone IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, USA). In breve, 100 l di sangue intero vengono colorati con quantità saturanti dei suddetti anticorpi monoclonali e dei corrispondenti controlli isotipici. Dopo l'incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio secondo le raccomandazioni del produttore, OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) viene aggiunto per lisare RBC e i campioni vengono fissati. Le cellule fisse vengono analizzate mediante citometria a flusso entro 6 ore.

La determinazione della distribuzione dei sottoinsiemi di leucociti e monociti viene eseguita utilizzando un citometro FC500 (Beckman Coulter) e viene utilizzato il software di analisi CXP (versione 2.2) (Schroers et al., 2005). I monociti sono identificati come cellule CD45 positive e CD56 negative che presentano uno specifico profilo di dispersione in avanti e lateralmente. I monociti vengono quindi inseriti in un dot plot SSC/CD, identificando i monociti come cellule CD86 con proprietà di dispersione dei monociti. I sottoinsiemi di monociti CD14 con e senza CD16 sono definiti in base al pattern di espressione superficiale del recettore lipopolisaccaridico CD14 e del CD16 (recettore Fcgamma III). Per ogni campione viene analizzato un milione di cellule e la percentuale di cellule mononucleate CD16 positive (CD14+/CD16+ e CD14++/CD16+) e il numero di cellule rispetto ai monociti totali vengono confrontati utilizzando microsfere fluorescenti (Flow-Count, Beckman Coulter). In questo studio viene utilizzato l'anticorpo CD86 (clone HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

Saggi di sCD14, LBP, zonulina e I-FABP

I marcatori LBP e sCD14 vengono utilizzati per monitorare la traslocazione microbica mentre la zonulina e l'I-FABP vengono misurati per esplorare la permeabilità intestinale: i livelli plasmatici di LBP vengono misurati utilizzando il test immunoenzimatico per la quantificazione del kit ELISA LBP umano libero, secondo le raccomandazioni del produttore. Il fattore di diluizione è 1:800. Il livello plasmatico di sCD14 viene misurato utilizzando il kit Human sCD14, secondo le specifiche del produttore. Il fattore di diluizione è 1:200. I livelli sierici di zonulina sono misurati utilizzando il kit Human zonulin ELISA. I livelli plasmatici di I-FABP sono misurati dal kit ELISA secondo le raccomandazioni del produttore.