Asociación de marcadores inflamatorios y de translocación microbiana del estreñimiento

Diseño del estudio y población

Pacientes y métodos 2.1. Selección de pacientes Se reclutan 200 pacientes de hemodiálisis. El estreñimiento funcional se diagnosticará según los criterios de Roma IV. Las lesiones orgánicas de la cavidad abdominal y del suelo pélvico se excluyen en todos los pacientes mediante evaluación endoscópica (sigmoidoscopia, colonoscopia, gastroduodenoscopia), radiológica y ultrasonográfica.

Este estudio se llevará a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki revisada en 2008. Todos los pacientes darán su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. Todos los pacientes de la división renal del Tungs Taichung Metroharbour Hospital se incluyeron prospectiva y consecutivamente. Los criterios de inclusión son

1. Hemodiálisis por más de 3 meses
2. Edad mayor de 20 años

Los criterios de exclusión son antecedentes de enfermedad inflamatoria crónica, presencia de infección actual, enfermedad vascular del colágeno o tratamiento inmunomodulador o inmunosupresor.

Mediciones de citocinas inflamatorias, etotaxina-1 y amiloide A

Los niveles plasmáticos de MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A y calprotectina se prueban mediante un kit ELISA humano disponible comercialmente, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de eotaxina1 en suero humano se determinan utilizando un kit ELISA comercial (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El procedimiento ELISA comercialmente disponible se usa para medir la concentración sérica de amiloide A en suero,

Endotoxina y Endotoxina Ig M, así como anticuerpo central IgG

La endotoxina se mide en suero mediante Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 de Lonza (catálogo # 50-647U) (EU/ml). Las muestras de suero o plasma se diluyen en una proporción de 1∶5 con agua reactiva LAL. Los anticuerpos del núcleo de endotoxina IgG se miden en plasma utilizando un kit ELISA de Cell Sciences Inc (catálogo # HK504). Las unidades se expresan como GMU/ml, que son unidades medianas estándar de IgG basadas en medianas de rangos de 1000 adultos sanos por el fabricante.

Determinación del fenotipo mononuclear CD14 y CD16

La sangre periférica se recolectará por venopunción utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante. Para el análisis citométrico, anticuerpos monoclonales contra CD14 (isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado; clon RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, EE. UU.), CD16 (ficoeritrina (PE) conjugado; clon 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, EE. UU.), Se utilizan CD45 (ficoeritrina cianina-5 (PC5); clon J33; Beckman Coulter, Miami, FL, EE. UU.) y CD56 (clon IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, EE. UU.). Brevemente, 100 l de la sangre completa se tiñen con cantidades saturadas de los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente y los controles de isotipo correspondientes. Después de incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad según las recomendaciones del fabricante, se añade OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) para lisar los RBC y se fijan las muestras. Las células fijadas se analizan mediante citometría de flujo en 6 horas.

La determinación de la distribución de subconjuntos de leucocitos y monocitos se realiza utilizando un citómetro FC500 (Beckman Coulter) y se utiliza el software de análisis CXP (versión 2.2) (Schroers et al., 2005). Los monocitos se identifican como células positivas para CD45 y negativas para CD56 que muestran un perfil de dispersión frontal y lateral específico. A continuación, los monocitos se seleccionan en un gráfico de puntos SSC/CD, identificando los monocitos como células CD86 con propiedades de dispersión de monocitos. Los subconjuntos de monocitos CD14 con y sin CD16 se definen según el patrón de expresión superficial del receptor de lipopolisacárido CD14 y el CD16 (receptor Fcgamma III). Se analiza un millón de células de cada muestra y se compara el porcentaje de células mononucleares CD16 positivas (CD14+/CD16+ y CD14++/CD16+) y el número de células del total de monocitos utilizando microesferas fluorescentes (Flow-Count, Beckman Coulter). En este estudio se utiliza el anticuerpo CD86 (clon HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, EE. UU.).

Ensayos de sCD14, LBP, zonulina e I-FABP

Los marcadores LBP y sCD14 se utilizan para controlar la translocación microbiana, mientras que Zonulin e I-FABP se miden para explorar la permeabilidad intestinal: los niveles plasmáticos de LBP se miden mediante el inmunoensayo enzimático para la cuantificación del kit ELISA de LBP humano libre, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El factor de dilución es 1:800. El nivel plasmático de sCD14 se mide utilizando el kit Human sCD14, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El factor de dilución es 1:200. Los niveles séricos de zonulina se miden utilizando el kit ELISA de zonulina humana. Los niveles plasmáticos de I-FABP se miden con el kit ELISA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.