Association of Constipation Inflammatory and Microbial Translocation Markers

Studiedesign og befolkning

Pasienter og metoder 2.1. Pasientvalg To hundre hemodialysepasienter rekrutteres. Funksjonell forstoppelse vil bli diagnostisert i henhold til Roma IV-kriteriene. Organiske lesjoner i bukhulen og bekkenbunnen utelukkes hos alle pasienter ved endoskopisk (sigmoidoskopi, koloskopi, gastroduodenoskopi), radiologisk og ultrasonografisk evaluering.

Denne studien vil bli utført i samsvar med Helsinki-erklæringen som ble revidert i 2008. Alle pasienter vil gi skriftlig informert samtykke til å delta i studien. Alle pasienter i nyreavdelingen ved Tungs Taichung Metroharbour Hospital ble inkludert prospektivt og fortløpende. Inklusjonskriteriene er

1. Hemodialyse i mer enn 3 måneder
2. Alder eldre enn 20 år

Eksklusjonskriteriene er en historie med kronisk inflammatorisk sykdom, tilstedeværelse av nåværende infeksjon, kollagen vaskulær sykdom eller immunmodulerende eller immunsuppressiv behandling.

Målinger av inflammatoriske cytokiner, etotaxin-1 og amyloid A

Plasmanivåene av MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A og calprotectin testes med henholdsvis kommersielt tilgjengelig humant ELISA-sett, i henhold til produsentens instruksjoner. Humant serum eotaxin1-nivåer bestemmes ved hjelp av et kommersielt ELISA-sett (R&D-systemer, Minneapolis, MN, USA) i henhold til produsentens protokoll. Den kommersielt tilgjengelige ELISA-prosedyren brukes til å måle serumamyloid A-konsentrasjon i serum,

Endotoksin og endotoksin Ig M samt IgG kjerneantistoff

Endotoksin måles i serum av Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 fra Lonza (katalog nr. 50-647U)(EU/ml). Serum- eller plasmaprøver fortynnes i forholdet 1∶5 med LAL-reagensvann. Endotoksin IgG kjerneantistoffer måles i plasma ved bruk av et ELISA-sett fra Cell Sciences Inc (katalog # HK504). Enheter er uttrykt som GMU/ml, som er IgG-standard medianenheter basert på medianverdier på 1000 friske voksne av produsenten.

Bestemmelse av CD14 og CD16 mononukleær fenotype

Perifert blod vil bli samlet inn ved venepunktur med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) som antikoagulant. For cytometrisk analyse, monoklonale antistoffer mot CD14 (fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugert; klon RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD16 (fykoerytrin (PE) konjugert; klon 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD45 (phycoerythrin cyanin-5 (PC5); klon J33; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) og CD56 (klon IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) brukes. Kort fortalt farges 100 l av fullblodet med mettende mengder av de ovenfor nevnte monoklonale antistoffene og tilsvarende isotypekontroller. Etter inkubering i 15 minutter ved romtemperatur i mørke i henhold til produsentens anbefalinger, tilsettes OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) for å lysere RBC og prøvene fikseres. Faste celler analyseres ved flowcytometri innen 6 timer.

Bestemmelse av leukocytt- og monocyttsubsettfordeling utføres ved bruk av et FC500-Cytometer (Beckman Coulter), og CXP-analyseprogramvare (versjon 2.2) brukes (Schroers et al., 2005). Monocytter identifiseres som CD45-positive og CD56-negative celler som viser en spesifikk spredningsprofil forover og sidelengs. Monocytter blir deretter lukket i et SSC/CD-punktplott, og identifiserer monocytter som CD86-celler med monocyttspredningsegenskaper. Undergrupper av CD14-monocytter med og uten CD16 er definert i henhold til overflateekspresjonsmønsteret til lipopolysakkaridreseptoren CD14 og CD16 (Fcgamma-reseptor III). En million celler analyseres fra hver prøve, og prosentandelen av CD16 positive mononukleære celler (CD14+/CD16+ og CD14++/CD16+) og antall celler ut av de totale monocyttene sammenlignes ved bruk av fluorescerende mikrokuler (Flow-Count, Beckman Coulter). CD86-antistoffet (klon HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) brukes i denne studien.

sCD14, LBP, zonulin og I-FABP analyser

LBP- og sCD14-markører brukes til å overvåke den mikrobielle translokasjonen mens Zonulin og I-FABP måles for å utforske intestinal permeabilitet: LBP-plasmanivåer måles ved bruk av Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP ELISA kit, i henhold til produsentens anbefalinger. Fortynningsfaktor er 1:800. Plasmanivået til sCD14 måles med Human sCD14-sett, i henhold til produsentens spesifikasjoner. Fortynningsfaktor er 1:200. Zonulinserumnivåer måles ved bruk av Human zonulin ELISA-sett. I-FABP-plasmanivåer måles med ELISA-sett i henhold til produsentens anbefalinger.