Stowarzyszenie markerów zapalnych zaparć i translokacji drobnoustrojów

Projekt badania i populacja

Pacjenci i metody 2.1. Selekcja pacjentów Rekrutuje się dwustu pacjentów poddawanych hemodializie. Zaparcia czynnościowe będą diagnozowane zgodnie z Kryteriami Rzymskimi IV. U wszystkich chorych wyklucza się zmiany organiczne jamy brzusznej i dna miednicy w ocenie endoskopowej (sigmoidoskopia, kolonoskopia, gastroduodenoskopia), radiologicznej i ultrasonograficznej.

Badanie to zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską zmienioną w 2008 r. Wszyscy pacjenci wyrażą pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Wszyscy pacjenci z oddziału nerkowego szpitala Tungs Taichung Metroharbour zostali włączeni prospektywnie i kolejno. Kryteria włączenia to

1. Hemodializa przez ponad 3 miesiące
2. Wiek powyżej 20 lat

Kryteria wykluczenia to przewlekła choroba zapalna w wywiadzie, obecność aktualnej infekcji, choroba naczyń kolagenowych lub leczenie immunomodulujące lub immunosupresyjne.

Pomiary cytokin zapalnych, etotaksyny-1 i amyloidu A

Poziomy MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A i kalprotektyny w osoczu oznacza się odpowiednio dostępnym w handlu zestawem ELISA dla ludzi, zgodnie z instrukcją producenta. Poziom eotaksyny 1 w surowicy ludzkiej określa się przy użyciu dostępnego w handlu zestawu ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) zgodnie z protokołem producenta. Dostępna na rynku procedura ELISA służy do pomiaru stężenia amyloidu A w surowicy,

Endotoksyna i Endotoksyna Ig M oraz przeciwciało rdzeniowe IgG

Endotoksynę mierzy się w surowicy za pomocą Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 firmy Lonza (nr kat. 50-647U) (EU/ml). Próbki surowicy lub osocza rozcieńcza się w stosunku 1∶5 wodą z odczynnikiem LAL. Przeciwciała rdzeniowe IgG endotoksyny mierzy się w osoczu przy użyciu zestawu ELISA firmy Cell Sciences Inc (nr katalogowy HK504). Jednostki wyrażono jako GMU/ml, które są standardowymi medianami jednostek IgG w oparciu o mediany zakresów 1000 zdrowych dorosłych według producenta.

Określenie fenotypu jednojądrzastego CD14 i CD16

Krew obwodowa zostanie pobrana przez nakłucie żyły przy użyciu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) jako antykoagulantu. Do analizy cytometrycznej przeciwciała monoklonalne przeciwko CD14 (sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC); klon RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD16 (sprzężone z fikoerytryną (PE); klon 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), Stosowane są CD45 (fikoerytryna cyjanina-5 (PC5); klon J33; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) i CD56 (klon IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Pokrótce, 100 ul krwi pełnej barwi się wysycającymi ilościami wyżej wymienionych przeciwciał monoklonalnych i odpowiednimi kontrolami izotypowymi. Po inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności zgodnie z zaleceniami producenta, dodaje się OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) w celu lizy RBC i próbki utrwala. Utrwalone komórki analizuje się metodą cytometrii przepływowej w ciągu 6 godzin.

Określenie rozkładu podzbioru leukocytów i monocytów przeprowadza się przy użyciu cytometru FC500 (Beckman Coulter) i stosuje się oprogramowanie do analizy CXP (wersja 2.2) (Schroers i in., 2005). Monocyty identyfikuje się jako komórki CD45-dodatnie i CD56-ujemne wykazujące specyficzny profil rozproszenia do przodu i na boki. Monocyty są następnie bramkowane na wykresie punktowym SSC/CD, identyfikując monocyty jako komórki CD86 z właściwościami rozpraszania monocytów. Podzbiory monocytów CD14 z CD16 i bez CD16 definiuje się zgodnie z wzorem ekspresji powierzchniowej receptora lipopolisacharydowego CD14 i CD16 (receptor Fcgamma III). Z każdej próbki analizuje się milion komórek i porównuje się odsetek komórek jednojądrzastych CD16-dodatnich (CD14+/CD16+ i CD14++/CD16+) oraz liczbę komórek spośród wszystkich monocytów za pomocą fluorescencyjnych mikrokulek (Flow-Count, Beckman Coulter). W tym badaniu stosuje się przeciwciało CD86 (klon HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

testy sCD14, LBP, zonuliny i I-FABP

Markery LBP i sCD14 stosuje się do monitorowania translokacji mikrobiologicznej, podczas gdy zonulin i I-FABP są mierzone w celu zbadania przepuszczalności jelitowej: Poziomy LBP w osoczu są mierzone przy użyciu zestawu Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP ELISA, zgodnie z zaleceniami producenta. Współczynnik rozcieńczenia wynosi 1:800. Poziom sCD14 w osoczu mierzy się przy użyciu zestawu Human sCD14, zgodnie z zaleceniami producenta. Współczynnik rozcieńczenia wynosi 1:200. Poziomy zonuliny w surowicy mierzono przy użyciu zestawu Human zonulin ELISA. Poziomy I-FABP w osoczu są mierzone za pomocą zestawu ELISA zgodnie z zaleceniami producenta.