Vereniging van constipatie Inflammatoire en microbiële translocatiemarkers

Studieontwerp en populatie

Patiënten en methoden 2.1. Patiëntenselectie Er worden tweehonderd hemodialysepatiënten geworven. Functionele constipatie wordt gediagnosticeerd volgens de Rome IV-criteria. Organische laesies van de buikholte en de bekkenbodem worden bij alle patiënten uitgesloten door endoscopische (sigmoïdoscopie, colonoscopie, gastroduodenoscopie), radiologische en echografische evaluatie.

Deze studie zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki zoals herzien in 2008. Alle patiënten zullen schriftelijke geïnformeerde toestemming geven om deel te nemen aan het onderzoek. Alle patiënten op de nierafdeling van het Tungs Taichung Metroharbour Hospital werden prospectief en achtereenvolgens geïncludeerd. De inclusiecriteria zijn

1. Hemodialyse gedurende meer dan 3 maanden
2. Leeftijd ouder dan 20 jaar

De uitsluitingscriteria zijn een voorgeschiedenis van chronische ontstekingsziekte, de aanwezigheid van een actuele infectie, collageenvasculaire ziekte of immunomodulerende of immunosuppressieve behandeling.

Metingen van inflammatoire cytokines, etotaxine-1 en amyloïde A

De plasmaspiegels van MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A en calprotectine worden respectievelijk getest met in de handel verkrijgbare humane ELISA-kits, volgens de instructies van de fabrikant. De niveaus van eotaxine1 in menselijk serum worden bepaald met behulp van een commerciële ELISA-kit (R&D-systemen, Minneapolis, MN, VS) volgens het protocol van de fabrikant. De in de handel verkrijgbare ELISA-procedure wordt gebruikt om de serumamyloïde A-concentratie in serum te meten,

Endotoxine en endotoxine Ig M evenals IgG-kernantilichaam

Endotoxine wordt gemeten in serum door Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 van Lonza (catalogus # 50-647U) (EU/ml). Serum- of plasmamonsters worden verdund in een verhouding van 1∶5 met LAL-reagenswater. Endotoxine IgG-kernantilichamen worden gemeten in plasma met behulp van een ELISA-kit van Cell Sciences Inc (catalogus # HK504). Eenheden worden uitgedrukt als GMU/ml, wat IgG-standaard mediaaneenheden zijn, gebaseerd op medianen van bereiken van 1000 gezonde volwassenen door de fabrikant.

Bepaling van CD14 en CD16 mononucleair fenotype

Perifeer bloed wordt verzameld door middel van venapunctie met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) als antistollingsmiddel. Voor cytometrische analyse, monoklonale antilichamen tegen CD14 (fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd; kloon RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, VS), CD16 (fycoerythrine (PE) geconjugeerd; kloon 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, VS), CD45 (fycoerythrinecyanine-5 (PC5); kloon J33; Beckman Coulter, Miami, FL, VS) en CD56 (kloon IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, VS) worden gebruikt. In het kort wordt 100 1 van het volbloed gekleurd met verzadigende hoeveelheden van de bovengenoemde monoklonale antilichamen en overeenkomstige isotypecontroles. Na incubatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker volgens de aanbevelingen van de fabrikant, wordt OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) toegevoegd om RBC te lyseren en worden de monsters gefixeerd. Vaste cellen worden binnen 6 uur door middel van flowcytometrie geanalyseerd.

Bepaling van de subgroepdistributie van leukocyten en monocyten wordt uitgevoerd met behulp van een FC500-cytometer (Beckman Coulter) en er wordt CXP-analysesoftware (versie 2.2) gebruikt (Schroers et al., 2005). Monocyten worden geïdentificeerd als CD45-positieve en CD56-negatieve cellen die een specifiek voorwaarts en zijwaarts verstrooiingsprofiel vertonen. Monocyten worden vervolgens gepoort in een SSC/CD-puntgrafiek, waarbij monocyten worden geïdentificeerd als CD86-cellen met eigenschappen van monocytverstrooiing. Subsets van CD14-monocyten met en zonder CD16 worden gedefinieerd volgens het oppervlakte-expressiepatroon van de lipopolysaccharidereceptor CD14 en de CD16 (Fcgamma-receptor III). Van elk monster worden één miljoen cellen geanalyseerd en het percentage CD16-positieve mononucleaire cellen (CD14+/CD16+ en CD14++/CD16+) en het aantal cellen van het totale aantal monocyten worden vergeleken met behulp van fluorescerende microbeads (Flow-Count, Beckman Coulter). Het CD86-antilichaam (kloon HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, VS) wordt in deze studie gebruikt.

sCD14-, LBP-, zonuline- en I-FABP-assays

LBP- en sCD14-markers worden gebruikt om de microbiële translocatie te volgen, terwijl Zonulin en I-FABP worden gemeten om de darmpermeabiliteit te onderzoeken: LBP-plasmaspiegels worden gemeten met behulp van Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP ELISA kit, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verdunningsfactor is 1:800. Het plasmaniveau van sCD14 wordt gemeten met behulp van de Human sCD14-kit, volgens de specificaties van de fabrikant. Verdunningsfactor is 1:200. Zonuline-serumspiegels worden gemeten met behulp van de Human zonuline ELISA-kit. I-FABP-plasmaspiegels worden gemeten door ELISA-kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.