Associação de Marcadores de Translocação Microbiana e Inflamatória de Constipação

Desenho do estudo e população

Doentes e métodos 2.1. Seleção de pacientes Duzentos pacientes de hemodiálise são recrutados. A constipação funcional será diagnosticada de acordo com os critérios de Roma IV. Lesões orgânicas da cavidade abdominal e do assoalho pélvico são excluídas em todos os pacientes por avaliação endoscópica (sigmoidoscopia, colonoscopia, gastroduodenoscopia), radiológica e ultrassonográfica.

Este estudo será realizado de acordo com a Declaração de Helsinque revisada em 2008. Todos os pacientes darão consentimento informado por escrito para participar do estudo. Todos os pacientes da divisão renal do Tungs Taichung Metroharbour Hospital foram prospectiva e consecutivamente incluídos. Os critérios de inclusão são

1. Hemodiálise por mais de 3 meses
2. Idade superior a 20 anos

Os critérios de exclusão são história de doença inflamatória crônica, presença de infecção atual, doença vascular do colágeno ou tratamento imunomodulador ou imunossupressor.

Medições de citocinas inflamatórias, etotaxina-1 e amiloide A

Os níveis plasmáticos de MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A e calprotectina são testados por kit ELISA humano disponível comercialmente, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de eotaxina1 no soro humano são determinados usando um kit ELISA comercial (R&D systems, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O procedimento ELISA disponível comercialmente é usado para medir a concentração sérica de amilóide A no soro,

Endotoxina e Endotoxina Ig M, bem como anticorpo de núcleo IgG

A endotoxina é medida no soro por Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 da Lonza (catálogo # 50-647U) (EU/ml). As amostras de soro ou plasma são diluídas na proporção de 1∶5 com água reagente LAL. Os anticorpos de núcleo de endotoxina IgG são medidos no plasma usando um kit ELISA da Cell Sciences Inc (catálogo # HK504). As unidades são expressas como GMU/ml, que são unidades medianas padrão de IgG baseadas em medianas de faixas de 1.000 adultos saudáveis ​​pelo fabricante.

Determinação do Fenótipo Mononuclear CD14 e CD16

O sangue periférico será coletado por punção venosa utilizando o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante. Para análise citométrica, anticorpos monoclonais contra CD14 (conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC); clone RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, EUA), CD16 (conjugado com ficoeritrina (PE); clone 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, EUA), CD45 (ficoeritrina cianina-5 (PC5); clone J33; Beckman Coulter, Miami, FL, EUA) e CD56 (clone IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, EUA) são usados. Resumidamente, 100 l de sangue total são corados com quantidades saturantes dos anticorpos monoclonais acima mencionados e correspondentes controles de isotipo. Após incubação por 15 min em temperatura ambiente no escuro de acordo com as recomendações do fabricante, OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) é adicionado para lisar RBC e as amostras são fixadas. As células fixadas são analisadas por citometria de fluxo em 6 horas.

A determinação da distribuição do subconjunto de leucócitos e monócitos é realizada usando um citômetro FC500 (Beckman Coulter) e o software de análise CXP (versão 2.2) é usado (Schroers et al., 2005). Os monócitos são identificados como células CD45 positivas e CD56 negativas exibindo um perfil de dispersão frontal e lateral específico. Os monócitos são então delimitados em um gráfico de pontos SSC/CD, identificando os monócitos como células CD86 com propriedades de dispersão de monócitos. Subconjuntos de monócitos CD14 com e sem CD16 são definidos de acordo com o padrão de expressão de superfície do receptor lipopolissacarídeo CD14 e CD16 (receptor Fcgama III). Um milhão de células são analisadas de cada amostra, e a porcentagem de células mononucleares CD16 positivas (CD14+/CD16+ e CD14++/CD16+) e o número de células do total de monócitos são comparados usando microesferas fluorescentes (Flow-Count, Beckman Coulter). O anticorpo CD86 (clone HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, EUA) é utilizado neste estudo.

Ensaios de sCD14, LBP, zonulina e I-FABP

Marcadores LBP e sCD14 são usados ​​para monitorar a translocação microbiana enquanto Zonulin e I-FABP são medidos para explorar a permeabilidade intestinal: Os níveis plasmáticos de LBP são medidos usando o kit Enzima Imunoensaio para Quantificação de LBP humano livre ELISA, de acordo com as recomendações do fabricante. O fator de diluição é 1:800. O nível plasmático de sCD14 é medido usando o kit Human sCD14, de acordo com as especificações do fabricante. O fator de diluição é 1:200. Os níveis séricos de zonulina são medidos usando o kit Human zonulin ELISA. Os níveis plasmáticos de I-FABP são medidos pelo kit ELISA de acordo com as recomendações do fabricante.