Ассоциация маркеров воспаления и микробной транслокации запоров

Дизайн исследования и популяция

Пациенты и методы 2.1. Отбор пациентов Набирают двести пациентов, находящихся на гемодиализе. Функциональный запор диагностируется в соответствии с Римскими критериями IV. Органические поражения брюшной полости и тазового дна исключаются у всех больных эндоскопическим (ректороманоскопия, колоноскопия, гастродуоденоскопия), рентгенологическим и ультразвуковым исследованием.

Это исследование будет проводиться в соответствии с Хельсинкской декларацией, пересмотренной в 2008 году. Все пациенты дадут письменное информированное согласие на участие в исследовании. Все пациенты почечного отделения больницы Tungs Taichung Metroharbour Hospital были включены проспективно и последовательно. Критерии включения

1. Гемодиализ более 3 мес.
2. Возраст старше 20 лет

Критериями исключения являются хронические воспалительные заболевания в анамнезе, наличие текущей инфекции, коллагенозы сосудов или иммуномодулирующее или иммуносупрессивное лечение.

Измерения воспалительных цитокинов, этотаксина-1 и амилоида А

Уровни MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A и кальпротектина в плазме проверяют с помощью имеющегося в продаже набора ELISA для человека, соответственно, в соответствии с инструкциями производителя. Уровни эотаксина 1 в сыворотке человека определяют с использованием коммерческого набора ELISA (R&D systems, Миннеаполис, Миннесота, США) в соответствии с протоколом производителя. Коммерчески доступная процедура ELISA используется для измерения концентрации сывороточного амилоида А в сыворотке,

Эндотоксин и эндотоксин Ig M, а также ядро-антитело IgG

Эндотоксин измеряют в сыворотке с помощью Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 от Lonza (номер по каталогу 50-647U) (ЕС/мл). Образцы сыворотки или плазмы разбавляют в соотношении 1:5 водой с ЛАЛ-реагентом. Ядерные антитела IgG к эндотоксину измеряют в плазме с использованием набора ELISA от Cell Sciences Inc (номер по каталогу HK504). Единицы выражены в виде GMU/мл, которые представляют собой стандартные медианные единицы IgG, основанные на медианах диапазонов для 1000 здоровых взрослых, указанных производителем.

Определение мононуклеарного фенотипа CD14 и CD16

Периферическую кровь собирают путем венепункции с использованием этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве антикоагулянта. Для цитометрического анализа моноклональные антитела против CD14 (конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC); клон RMO52; Beckman Coulter, Майами, Флорида, США), CD16 (конъюгированные с фикоэритрином (PE); клон 3G8; Beckman Coulter, Майами, Флорида, США). Используют CD45 (фикоэритринцианин-5 (PC5); клон J33; Beckman Coulter, Майами, Флорида, США) и CD56 (клон IM2073; Beckman Coulter, Майами, Флорида, США). Вкратце, 100 мкл цельной крови окрашивают насыщающими количествами вышеупомянутых моноклональных антител и соответствующих контролей изотипов. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте в соответствии с рекомендациями производителя к лизису эритроцитов добавляют OptiLyse C (Beckman Coulter, Майами, Флорида) и образцы фиксируют. Фиксированные клетки анализируют с помощью проточной цитометрии в течение 6 часов.

Определение распределения субпопуляций лейкоцитов и моноцитов проводят с использованием цитометра FC500 (Beckman Coulter) и программного обеспечения для анализа CXP (версия 2.2) (Schroers et al., 2005). Моноциты идентифицируют как CD45-положительные и CD56-отрицательные клетки, демонстрирующие специфический профиль прямого и бокового рассеяния. Моноциты затем гейтируются на точечной диаграмме SSC/CD, идентифицируя моноциты как клетки CD86 со свойствами рассеяния моноцитов. Подмножества моноцитов CD14 с CD16 и без него определяются в соответствии с характером поверхностной экспрессии липополисахаридного рецептора CD14 и CD16 (Fcgamma рецептор III). Из каждого образца анализируют один миллион клеток и сравнивают процент CD16-положительных мононуклеарных клеток (CD14+/CD16+ и CD14++/CD16+) и количество клеток от общего числа моноцитов с использованием флуоресцентных микрогранул (Flow-Count, Beckman Coulter). В этом исследовании используется антитело к CD86 (клон HA5.2B7; Beckman Coulter, Майами, Флорида, США).

Анализы sCD14, LBP, зонулина и I-FABP

Маркеры LBP и sCD14 используются для мониторинга микробной транслокации, в то время как зоналин и I-FABP измеряются для изучения кишечной проницаемости: уровни LBP в плазме измеряются с использованием набора для иммуноферментного анализа для количественного определения свободной человеческой LBP ELISA в соответствии с рекомендациями производителя. Коэффициент разбавления 1:800. Уровень sCD14 в плазме измеряют с использованием набора Human sCD14 в соответствии со спецификациями производителя. Коэффициент разбавления 1:200. Уровни зонулина в сыворотке измеряют с использованием набора ELISA для человеческого зонулина. Уровни I-FABP в плазме измеряют с помощью набора ELISA в соответствии с рекомендациями производителя.