Asociace zánětlivých a mikrobiálních translokačních markerů zácpy

Design studie a populace

Pacienti a metody 2.1. Výběr pacientů Bylo přijato 200 hemodialyzovaných pacientů. Funkční zácpa bude diagnostikována podle kritérií Říma IV. Organické léze břišní dutiny a pánevního dna jsou vyloučeny u všech pacientů endoskopickým (sigmoidoskopie, kolonoskopie, gastroduodenoskopie), radiologickým a ultrasonografickým vyšetřením.

Tato studie bude provedena v souladu s Helsinskou deklarací revidovanou v roce 2008. Všichni pacienti dají písemný informovaný souhlas s účastí ve studii. Všichni pacienti v renální divizi nemocnice Tungs Taichung Metroharbour Hospital byli prospektivně a následně zahrnuti. Kritéria pro zařazení jsou

1. Hemodialýza déle než 3 měsíce
2. Věk starší 20 let

Kritéria pro vyloučení jsou anamnéza chronického zánětlivého onemocnění, přítomnost současné infekce, kolagenní vaskulární onemocnění nebo imunomodulační nebo imunosupresivní léčba.

Měření zánětlivých cytokinů, etotaxinu-1 a amyloidu A

Plazmatické hladiny MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A a kalprotektinu jsou testovány komerčně dostupnou humánní soupravou ELISA podle pokynů výrobce. Hladiny eotaxinu1 v lidském séru se stanoví pomocí komerční soupravy ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) podle protokolu výrobce. Komerčně dostupný postup ELISA se používá k měření koncentrace sérového amyloidu A v séru,

Endotoxin a endotoxin Ig M, stejně jako základní protilátka IgG

Endotoxin se měří v séru Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 od Lonza (katalogové č. 50-647U) (EU/ml). Vzorky séra nebo plazmy se zředí v poměru 1∶5 vodou s reagencií LAL. Endotoxinové IgG jádrové protilátky se měří v plazmě za použití ELISA kitu od Cell Sciences Inc (katalogové č. HK504). Jednotky jsou vyjádřeny jako GMU/ml, což jsou standardní střední jednotky IgG založené na mediánech v rozmezích 1000 zdravých dospělých podle výrobce.

Stanovení mononukleárního fenotypu CD14 a CD16

Periferní krev bude odebírána venepunkcí s použitím kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) jako antikoagulantu. Pro cytometrickou analýzu byly použity monoklonální protilátky proti CD14 (fluorescein isothiokyanát (FITC) konjugovaný; klon RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD16 (fykoerythrin (PE) konjugovaný; klon 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), Používají se CD45 (fykoerythrin cyanin-5 (PC5); klon J33; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) a CD56 (klon IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Stručně řečeno, 100 l plné krve se obarví saturačním množstvím výše uvedených monoklonálních protilátek a odpovídajícími izotypovými kontrolami. Po inkubaci po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě podle doporučení výrobce se přidá OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) pro lýzu RBC a vzorky se fixují. Fixované buňky jsou analyzovány průtokovou cytometrií během 6 hodin.

Stanovení distribuce podskupiny leukocytů a monocytů se provádí pomocí FC500-Cytometru (Beckman Coulter) a používá se software pro analýzu CXP (verze 2.2) (Schroers et al., 2005). Monocyty jsou identifikovány jako CD45 pozitivní a CD56 negativní buňky vykazující specifický dopředný a boční rozptylový profil. Monocyty jsou poté hradlovány v bodovém grafu SSC/CD, přičemž se monocyty identifikují jako buňky CD86 s vlastnostmi rozptylu monocytů. Podskupiny CD14 monocytů s a bez CD16 jsou definovány podle vzoru povrchové exprese lipopolysacharidového receptoru CD14 a CD16 (Fcgamma receptor III). Z každého vzorku se analyzuje jeden milion buněk a procento CD16 pozitivních mononukleárních buněk (CD14+/CD16+ a CD14++/CD16+) a počet buněk z celkového počtu monocytů se porovná pomocí fluorescenčních mikrokuliček (Flow-Count, Beckman Coulter). V této studii se používá protilátka CD86 (klon HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

sCD14, LBP, zoulin a I-FABP testy

Markery LBP a sCD14 se používají k monitorování mikrobiální translokace, zatímco Zonulin a I-FABP se měří ke zkoumání střevní propustnosti: Plazmatické hladiny LBP se měří pomocí soupravy Enzyme Immunoassay pro kvantifikaci volného lidského LBP ELISA kitu, podle doporučení výrobce. Faktor ředění je 1:800. Plazmatická hladina sCD14 se měří pomocí sady Human sCD14 podle specifikací výrobce. Faktor ředění je 1:200. Hladiny zonulinu v séru se měří pomocí sady Human zoulin ELISA kit. Plazmatické hladiny I-FABP se měří soupravou ELISA podle doporučení výrobce.