Association of Constipation Inflammatory and Microbial Translocation Markers

Studiedesign och befolkning

Patienter och metoder 2.1. Patienturval Tvåhundra hemodialyspatienter rekryteras. Funktionell förstoppning kommer att diagnostiseras enligt Rom IV-kriterierna. Organiska lesioner i bukhålan och bäckenbotten utesluts hos alla patienter genom endoskopisk (sigmoidoskopi, koloskopi, gastroduodenoskopi), radiologisk och ultraljudsutvärdering.

Denna studie kommer att genomföras i enlighet med Helsingforsdeklarationen som reviderades 2008. Alla patienter kommer att ge skriftligt informerat samtycke till att delta i studien. Alla patienter i njuravdelningen på Tungs Taichung Metroharbour Hospital inkluderades prospektivt och konsekutivt. Inklusionskriterierna är

1. Hemodialys i mer än 3 månader
2. Ålder äldre än 20 år

Uteslutningskriterierna är en historia av kronisk inflammatorisk sjukdom, förekomst av aktuell infektion, kollagenkärlsjukdom eller immunmodulerande eller immunsuppressiv behandling.

Mätningar av inflammatoriska cytokiner, etotaxin-1 och amyloid A

Plasmanivåerna av MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A och calprotectin testas med kommersiellt tillgängligt humant ELISA-kit, enligt tillverkarens instruktioner. Humant serumnivåer av eotaxin1 bestäms med hjälp av ett kommersiellt ELISA-kit (R&D-system, Minneapolis, MN, USA) enligt tillverkarens protokoll. Det kommersiellt tillgängliga ELISA-förfarandet används för att mäta serumamyloid A-koncentrationen i serum,

Endotoxin och Endotoxin Ig M samt IgG-kärnantikropp

Endotoxin mäts i serum av Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 från Lonza (katalognummer 50-647U) (EU/ml). Serum- eller plasmaprover späds i förhållandet 1∶5 med LAL-reagensvatten. Endotoxin IgG-kärnantikroppar mäts i plasma med användning av ett ELISA-kit från Cell Sciences Inc (katalognummer HK504). Enheter uttrycks som GMU/ml som är IgG-standardmedianenheter baserade på medianvärden för intervall på 1000 friska vuxna av tillverkaren.

Bestämning av CD14 och CD16 mononukleär fenotyp

Perifert blod kommer att samlas in genom venpunktion med etylendiamintetraättiksyra (EDTA) som antikoagulant. För cytometrisk analys, monoklonala antikroppar mot CD14 (fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugerat; klon RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD16 (fykoerytrin (PE) konjugerat; klon 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD45 (fykoerytrin cyanin-5 (PC5); klon J33; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) och CD56 (klon IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) används. Kortfattat färgas 100 1 av helblodet med mättande mängder av de ovan nämnda monoklonala antikropparna och motsvarande isotypkontroller. Efter inkubation i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker enligt tillverkarens rekommendationer, tillsätts OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) för att lysera RBC och proverna fixeras. Fasta celler analyseras med flödescytometri inom 6 timmar.

Bestämning av leukocyt- och monocytundergruppsfördelning utförs med en FC500-Cytometer (Beckman Coulter), och CXP-analysmjukvara (version 2.2) används (Schroers et al., 2005). Monocyter identifieras som CD45-positiva och CD56-negativa celler som uppvisar en specifik spridningsprofil framåt och åt sidan. Monocyter gatas sedan i en SSC/CD-punktplot, som identifierar monocyter som CD86-celler med monocytspridningsegenskaper. Underuppsättningar av CD14-monocyter med och utan CD16 definieras enligt ytexpressionsmönstret för lipopolysackaridreceptorn CD14 och CD16 (Fcgamma-receptor III). En miljon celler analyseras från varje prov, och andelen CD16-positiva mononukleära celler (CD14+/CD16+ och CD14++/CD16+) och antalet celler av de totala monocyterna jämförs med användning av fluorescerande mikropärlor (Flow-Count, Beckman Coulter). CD86-antikroppen (klon HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) används i denna studie.

sCD14, LBP, zonulin och I-FABP analyser

LBP- och sCD14-markörer används för att övervaka den mikrobiella translokationen medan Zonulin och I-FABP mäts för att utforska intestinal permeabilitet: LBP-plasmanivåer mäts med Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP ELISA-kit, enligt tillverkarens rekommendationer. Utspädningsfaktorn är 1:800. Plasmanivån av sCD14 mäts med Human sCD14-kit, enligt tillverkarens specifikationer. Utspädningsfaktorn är 1:200. Zonulinserumnivåer mäts med humant zonulin ELISA-kit. I-FABP-plasmanivåer mäts med ELISA-kit enligt tillverkarens rekommendationer.