Assoziation von entzündlichen Verstopfungs- und mikrobiellen Translokationsmarkern

Studiendesign und Population

Patienten und Methoden 2.1. Patientenauswahl 200 Hämodialysepatienten werden rekrutiert. Funktionelle Verstopfung wird nach den Rom-IV-Kriterien diagnostiziert. Organische Läsionen der Bauchhöhle und des Beckenbodens werden bei allen Patienten durch endoskopische (Sigmoidoskopie, Koloskopie, Gastroduodenoskopie), radiologische und sonographische Abklärung ausgeschlossen.

Diese Studie wird in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki in der überarbeiteten Fassung von 2008 durchgeführt. Alle Patienten geben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie. Alle Patienten in der Nierenabteilung des Tungs Taichung Metroharbour Hospital wurden prospektiv und konsekutiv eingeschlossen. Einschlusskriterien sind

1. Hämodialyse länger als 3 Monate
2. Alter älter als 20 Jahre

Ausschlusskriterien sind eine Vorgeschichte einer chronisch entzündlichen Erkrankung, das Vorhandensein einer aktuellen Infektion, einer Kollagenose oder einer immunmodulatorischen oder immunsuppressiven Behandlung.

Messungen von entzündlichen Zytokinen, Etotaxin-1 und Amyloid A

Die Plasmaspiegel von MCP-1, IL-6, CRP, IL-17A und Calprotectin werden jeweils mit einem im Handel erhältlichen humanen ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers getestet. Humanserum-Eotaxin1-Spiegel werden unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Das im Handel erhältliche ELISA-Verfahren wird verwendet, um die Serum-Amyloid-A-Konzentration im Serum zu messen,

Endotoxin und Endotoxin Ig M sowie IgG-Core-Antikörper

Endotoxin wird im Serum durch Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 von Lonza (Katalog-Nr. 50-647U) (EU/ml) gemessen. Serum- oder Plasmaproben werden im Verhältnis 1∶5 mit LAL-Reagenzwasser verdünnt. Endotoxin-IgG-Core-Antikörper werden in Plasma unter Verwendung eines ELISA-Kits von Cell Sciences Inc (Katalog-Nr. HK504) gemessen. Die Einheiten werden als GMU/ml ausgedrückt, wobei es sich um IgG-Standard-Medianeinheiten handelt, die vom Hersteller auf Medianwerten von 1000 gesunden Erwachsenen basieren.

Bestimmung des mononukleären CD14- und CD16-Phänotyps

Peripheres Blut wird durch Venenpunktion unter Verwendung von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Antikoagulans entnommen. Zur zytometrischen Analyse monoklonale Antikörper gegen CD14 (Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiert; Klon RMO52; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD16 (Phycoerythrin (PE) konjugiert; Klon 3G8; Beckman Coulter, Miami, FL, USA), CD45 (Phycoerythrin Cyanin-5 (PC5); Klon J33; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) und CD56 (Klon IM2073; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) werden verwendet. Kurz gesagt werden 100 l des Vollbluts mit sättigenden Mengen der oben erwähnten monoklonalen Antikörper und entsprechenden Isotypkontrollen gefärbt. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln gemäß den Empfehlungen des Herstellers wird OptiLyse C (Beckman Coulter, Miami, FL) hinzugefügt, um RBC zu lysieren, und die Proben werden fixiert. Fixierte Zellen werden innerhalb von 6 Stunden durchflusszytometrisch analysiert.

Die Bestimmung der Leukozyten- und Monozyten-Untergruppenverteilung wird unter Verwendung eines FC500-Zytometers (Beckman Coulter) durchgeführt, und es wird eine CXP-Analysesoftware (Version 2.2) verwendet (Schroers et al., 2005). Monozyten werden als CD45-positive und CD56-negative Zellen identifiziert, die ein spezifisches Vorwärts- und Seitwärtsstreuungsprofil aufweisen. Monozyten werden dann in einem SSC/CD-Punktplot erfasst, wodurch Monozyten als CD86-Zellen mit Monozyten-Streuungseigenschaften identifiziert werden. Untergruppen von CD14-Monozyten mit und ohne CD16 werden gemäß dem Oberflächenexpressionsmuster des Lipopolysaccharid-Rezeptors CD14 und des CD16 (Fcgamma-Rezeptor III) definiert. Aus jeder Probe werden eine Million Zellen analysiert, und der Prozentsatz CD16-positiver mononukleärer Zellen (CD14+/CD16+ und CD14++/CD16+) und die Anzahl der Zellen der gesamten Monozyten werden unter Verwendung fluoreszierender Mikroperlen (Flow-Count, Beckman Coulter) verglichen. Der CD86-Antikörper (Klon HA5.2B7; Beckman Coulter, Miami, FL, USA) wird in dieser Studie verwendet.

sCD14-, LBP-, Zonulin- und I-FABP-Assays

LBP- und sCD14-Marker werden verwendet, um die mikrobielle Translokation zu überwachen, während Zonulin und I-FABP gemessen werden, um die intestinale Permeabilität zu untersuchen: LBP-Plasmaspiegel werden unter Verwendung des Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP ELISA Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Verdünnungsfaktor ist 1:800. Der Plasmaspiegel von sCD14 wird unter Verwendung des Human-sCD14-Kits gemäß den Spezifikationen des Herstellers gemessen. Verdünnungsfaktor ist 1:200. Die Zonulin-Serumspiegel werden mit dem humanen Zonulin-ELISA-Kit gemessen. I-FABP-Plasmaspiegel werden mit einem ELISA-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen.