Cinétique des réponses des cytokines nasales à la stimulation mécanique

La rhinite allergique (RA) et l'asthme allergique sont des manifestations courantes de l'allergie de type I, une maladie d'hypersensibilité médiée par les IgE dont on estime qu'elle touche jusqu'à 40 % de la population mondiale . L'IgE est produite par les cellules B et se lie à la surface des mastocytes et des basophiles via son récepteur Fce I de haute affinité (FceRI). La réticulation de l'IgE de surface par son allergène spécifique induit la dégranulation des cellules ainsi que la libération de médiateurs inflammatoires. Ce processus qui se développe en quelques minutes entraîne les symptômes oculaires, nasaux et pulmonaires typiques de la RA et de l'asthme tels que démangeaisons, rougeur des yeux, nez qui coule et/ou congestionné et respiration sifflante due à l'emprisonnement d'air résultant d'une obstruction des voies respiratoires inférieures. Certains patients peuvent également développer des réactions de phase tardive (RPL). Ces réponses se développent généralement 2 à 6 heures après l'exposition à l'allergène, culminent en intensité entre 6 et 9 heures et sont principalement caractérisées par un œdème tissulaire qui se manifeste par une obstruction du flux d'air dans les voies respiratoires.

Depuis l'introduction de dispositifs de prélèvement de fluide muqueux faciles à utiliser et hautement absorbants, les médiateurs impliqués dans les réponses allergiques immédiates et tardives et la cinétique de leur libération ont été bien caractérisés au cours des dernières années. Les efforts de l'Imperial College de Londres et des données non publiées du groupe d'enquêteurs à Vienne ont montré que les principaux médiateurs impliqués dans la phase immédiate comprennent les médiateurs dérivés des mastocytes (Tryptase, PGD2), les alarmines épithéliales (IL-33, sST2) et le complément (C3a , C4a, C5a, D-Dimère). Les médiateurs impliqués dans les réactions de phase tardive comprennent également les alarmines (sST2, TSLP), les cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), les médiateurs des neutrophiles (MMP-9) et les médiateurs des éosinophiles (EDN).

Cependant, ce qui est également devenu clair récemment grâce à des études contrôlées par placebo, c'est que certains médiateurs sont médiés mécaniquement (observations non publiées), étant libérés dans l'environnement extracellulaire à la suite du processus d'échantillonnage lui-même. Ceci est d'un intérêt vital car comprendre quelles cytokines sont mécaniques et lesquelles sont spécifiques à un allergène aidera à guider les futures études visant à cibler des biomarqueurs spécifiques pour le traitement ou la surveillance de la maladie. Afin de comprendre si la libération mécanique joue un rôle dans la réponse pathologique aux allergènes, différentes cohortes de patients devront être étudiées pour voir si leurs réponses diffèrent de quelque manière que ce soit.

Justification de l'étude

À la lumière de cela, les chercheurs proposent une étude pour étudier les effets de l'échantillonnage des muqueuses sur la libération de cytokines de l'épithélium nasal. Les chercheurs prévoient d'échantillonner différentes cohortes de patients (rhinite allergique, asthme allergique, non allergique) pour voir comment les effets mécaniques sont influencés par le prélèvement et le statut allergique ou non allergique. En incluant 10 patients dans chaque groupe, les chercheurs espèrent établir une plage de « normes » pour la libération mécanique des cytokines pertinentes pour les allergènes dans chaque groupe d'étude, ce qui contribuera à éclairer les futures études portant sur les réponses spécifiques aux allergènes. Afin de cartographier à la fois les réponses symptomatiques et objectives à l'échantillonnage des voies respiratoires, des scores de symptômes et des débitmètres des voies respiratoires seront utilisés. Pour cartographier la cinétique des réponses, les participants subiront un cours de temps d'échantillonnage muqueux au cours d'une période de 8 heures sur une seule journée. Comme aucune substance interventionnelle n'est administrée, cette étude comportera un risque très faible pour les personnes impliquées tout en apportant un éclairage important sur les réponses épithéliales à la manipulation mécanique.

Conception de l'étude Dans cette étude pilote monocentrique, un total de 36 patients (n = 12 par groupe) seront recrutés sur une base volontaire et recevront tous un prélèvement nasal. Les participants à l'étude subiront le prélèvement nasal en une seule visite.

Visite de dépistage

Procédure:

• Signature du formulaire de consentement éclairé
• Attribution du numéro de présélection
• Données démographiques
• Antécédents d'allergie
• Évaluation des critères d'admission et d'exclusion
• Test de grossesse pour les femmes si besoin SPT
• Antécédents médicaux
• Les patients déclarant des antécédents d'asthme devront fournir des preuves objectives d'obstruction et de réversibilité des voies respiratoires (réversibilité de la spirométrie ou PC20 méthacholine/histamine <8 mg)
• Médicament concomitant
• rhinoscopie antérieure
• SPT standard avec extrait commercial de : noisetier, frêne, mélange d'herbes, herbe à poux, armoise, D. pteronyssinus, D. farina, squames de chat et de chien, alternaria, cladosporium, histamine et contrôle négatif
• Prélèvement sanguin (max 60ml de sang hépariné et sérum) - Une partie de l'échantillon sanguin sera directement envoyée au laboratoire pour analyse des IgE totales, et des IgE spécifiques aux allergènes concernés. Du reste du sang, l'ARN sera préparé et stocké à -80°C et le sérum sera séparé et stocké à -20°C.
• prélèvement nasal (prélèvement par curette muqueuse et prélèvement de sécrétions nasales)

Visite d'échantillonnage

Procédure:

• Réévaluation des critères d'inclusion et d'exclusion (résultats IgE spécifiques aux allergènes)
• Enregistrement des médicaments concomitants
• Prélèvement sanguin de base
• Collecte d'échantillons nasaux de base pour les deux narines (échantillonnage des sécrétions nasales) à 0 min
• Score TNSS de base
• PNIF de base
• Enregistrement des événements indésirables (EI)

• Sang, PNIF, prélèvement nasal (les deux narines : prélèvement par curette muqueuse et prélèvement des sécrétions nasales) et score TNSS, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min, 360 min, 420 min, 480 min après le début du temps d'échantillonnage

  4 Procédures d'étude

4.1 Antécédents médicaux des participants, données démographiques, médication concomitante Les participants seront interrogés sur leurs antécédents médicaux, y compris les données démographiques et la médication concomitante, leurs symptômes allergiques, y compris l'intensité et la durée et leurs antécédents de médication allergique.

4.2 Antécédents d'allergie et score TNSS Il sera demandé aux participants de signaler la survenue d'éternuements, de rhinorrhée, de prurit nasal, de congestion nasale et de noter chaque symptôme. Ils utiliseront la méthode de score des symptômes suivante : 0 = absent ; 1 = léger - présent mais facilement toléré ; 2 = modéré - présent, le symptôme est gênant mais n'interfère pas avec les activités de la vie quotidienne ; 3 = sévère - le symptôme est difficile à tolérer et interfère avec les activités de la vie quotidienne.

4.3 Rhinoscopie antérieure La rhinoscopie antérieure sera effectuée une fois au cours de la visite de sélection pour exclure les variations anatomiques (par ex. déviation septale) ou des changements pathologiques (par ex. polypes nasaux). Elle sera réalisée à l'aide d'un spéculum avec le patient assis avec la tête légèrement en arrière.

4.4 Débitmètre nasal inspiratoire de pointe (PNIF) La portabilité et la facilité d'utilisation du PNIF offrent une opportunité unique d'obtenir des mesures objectives. Il a également été récemment validé comme outil d'étude lors d'un test allergène nasal.

4.4.1 Mode opératoire : Le PNIF utilise un tube à diamètre variable calibré directement en litres par minute ainsi qu'une bague indicatrice à faible inertie. La position de l'anneau après une manœuvre inspiratoire indique le débit maximal atteint. L'appareil fonctionne lorsqu'un patient inhale par la bouche ou le nez, ce qui provoque l'aspiration d'air à travers le compteur et un curseur se déplace le long de l'échelle pour indiquer la vitesse d'inhalation. Le débit atteint peut être noté en vérifiant la position du curseur par rapport à l'échelle calibrée.

4.4.2 PNIF dans la conduite de l'étude : les participants seront formés à l'utilisation du PNIF le jour de l'étude, puis il sera utilisé à tous les moments de l'étude pour obtenir des informations sur le débit nasal.

4.5 Test cutané 4.5.1 Procédure : Les allergènes sont insérés dans le derme de l'avant-bras en piquant doucement la peau à travers une goutte (20 ul) d'une solution contenant des allergènes avec une lancette stérile avec au moins 2 cm entre chaque point d'application individuel. Une solution de chlorure de sodium à 0,9 % sera utilisée comme contrôle négatif et l'histamine comme contrôle positif. Chez les personnes précédemment sensibilisées, un gonflement avec démangeaisons et un rougissement de la peau (réaction de papule et de poussée) se produiront dans les 15 minutes suivant la provocation avec l'allergène respectif. Après 20 minutes, les solutions d'allergènes seront essuyées et les bords des papules seront tracés avec un stylo à bille. Une bande transparente sera collée sur la peau afin de transférer le contour de la papule sur la bande pour les enregistrements. La surface des papules sera calculée par planimétrie numérique. Pour l'inclusion, les papules d'au moins 3 mm de diamètre seront considérées comme des réactions positives.

4.5.2 Solutions de test : Un panel disponible dans le commerce de pollen d'arbres et de graminées, d'allergènes de mauvaises herbes et de plantes vivaces (Allergopharma, Vienne, Autriche) sera utilisé lors de la visite de dépistage et sera stocké conformément aux instructions du fabricant. Comme témoins, une solution stérile de NaCl à 0,9 % (témoin négatif) et de l'histamine (témoin positif, Allergopharma, Vienne, Autriche) seront utilisées. Ils seront stockés conformément aux instructions du fabricant.

4.5.3 SPT dans la conduite de l'étude :

Visite de dépistage:

Un test cutané standard avec un extrait commercial de pollen de bouleau et un panel d'allergènes de pollen d'arbres et de graminées, de mauvaises herbes et de plantes vivaces (tous Allergopharma, Vienne, Autriche) tels qu'utilisés dans le diagnostic de routine dans la clinique d'allergie du service ORL sera effectué pour évaluer le profil de sensibilisation des participants lors de la visite de dépistage.

4.5.4 Précautions de sécurité Par mesure de sécurité, les participants seront surveillés pendant 30 minutes après le test. Toutes les investigations seront effectuées dans la clinique externe du service ORL, où un équipement d'urgence complet est disponible.

4.6 Prélèvement sanguin et mesure des paramètres immunologiques Des prélèvements sanguins seront effectués lors de la visite de dépistage et lors de toutes les visites d'étude par ponction de la veine antécubitale avant le test cutané. Un maximum de 60 ml par visite sera prélevé soit sous héparine (par exemple pour les tests de sensibilité aux basophiles), soit pour la préparation de sérum (par exemple pour l'évaluation des taux d'immunoglobulines totales et spécifiques à l'allergène ou le test RBL). Les flacons de sérum seront traités et le sérum sera stocké à -20 °C. Les IgE spécifiques à l'allergène des échantillons de sang de la visite de dépistage seront mesurées par CAP-FEIA pour évaluer la classe RAST spécifique à l'allergène des patients. La mesure des IgE, IgG, IgA et IgM sériques totales, libres et allergènes spécifiques sera effectuée soit par CAP-FEIA, soit par mesure par microarray, soit par ELISA. Les médiateurs immunitaires seront mesurés à l'aide de la plateforme MSD, soit par nous, soit par nos collaborateurs d'AstraZeneca, Cambridge, Royaume-Uni. La mesure sera effectuée à la fin de l'étude dans tous les échantillons de sérum collectés afin de minimiser les variations inter-essais.

4.7 Test de grossesse Chez les participantes, la grossesse sera exclue avec un test de grossesse urinaire standard. Le test sera effectué avant le premier test cutané lors de la visite de dépistage et ensuite une fois par mois.

4.8 Prélèvement d'échantillons nasaux Le prélèvement d'échantillons nasaux sera effectué à toutes les visites. Pour chaque visite, des échantillons seront prélevés à l'aide de la nasosorption FXi/PU (contenant une matrice absorbante synthétique (SAM)), ou d'une curette en plastique de 10 cm de long (dispositifs de nasosorption de Hunt Developments, Royaume-Uni) (dispositifs de curette d'Arlington Scientific, États-Unis)

4.8.1 Nasosorption utilisant FXi/PU (Hunt Developments, Royaume-Uni). Sous visualisation, le dispositif sera inséré dans la cavité nasale et placé le long de la paroi latérale contre le cornet inférieur. L'index du patient sera utilisé pour appuyer sur les aspects externes des cartilages nasaux alaires et latéraux pour maintenir le dispositif en place. Après 1 minute, les dispositifs seront retirés puis congelés à -80°C.

4.8.2 Prélèvement d'ARNm muqueux Une curette nasale de 10 cm (soit Rhino-Probe, Arlington Scientific, États-Unis, soit Cellskim, Hunt Developments, Royaume-Uni) sera utilisée. Sous visualisation directe, la curette sera amenée à reposer contre la partie médiane inférieure du cornet inférieur. La curette sera pressée contre la surface muqueuse déplacée vers l'extérieur 2-3 fois. Ce mouvement sera répété 2 à 3 fois pour assurer une bonne collecte d'échantillons. Il a été démontré que cette curette et cette technique ne causent aucun inconfort significatif aux participants et ont donc l'avantage de ne nécessiter aucune anesthésie locale. Après la collecte, les cellules seront lysées dans du tampon Qiagen RLT et stockées à -80 ° C pour une analyse ultérieure de l'ARNm.

5 Produits expérimentaux et médicaments à l'étude 5.3 Médicaments concomitants 5.3.1 Généralités Tous les médicaments supplémentaires pris par les sujets à l'entrée dans l'étude ou à tout moment pendant l'étude sont considérés comme des médicaments concomitants et seront documentés dans le CRF. Les médicaments concomitants doivent être réduits au minimum pendant l'étude, mais si cela est jugé nécessaire, ils peuvent être administrés s'ils n'interfèrent pas avec le protocole de l'étude.

5.3.2 Médicament de secours Bien que les événements anaphylactiques soient très peu probables dans cette étude, ils doivent toujours être considérés comme possibles. Par conséquent, une trousse d'urgence complète sera disponible immédiatement en cas de réactions anaphylactiques au SPT. De plus, si le participant souffre de forts symptômes cutanés après le SPT, desloratadine 5 mg sera fourni pour améliorer les symptômes.

5.3.3 Médicaments concomitants interdits

Les sujets doivent rester sans médicaments interférant avec les procédures d'étude pendant toute la durée de l'étude. Les traitements concomitants suivants ne sont pas autorisés au cours de cette étude :

• Corticostéroïdes systémiques ou topiques
• Autres médicaments immunosuppresseurs
• Antihistaminiques ou cromoglycate disodique 3 jours avant la visite de dépistage
• Médicaments adrénergiques systémiques ou intranasaux
• Médicaments psychopharmacologiques

• Inhibiteurs de l'ECA ou bêta-bloquants

  6 Événements indésirables Un événement indésirable est tout événement au cours d'une étude clinique, y compris une maladie ou un accident intercurrent, qui altère le bien-être du sujet ; il peut également prendre la forme d'une valeur de laboratoire anormale. Le terme événement indésirable n'implique pas de relation causale avec le traitement à l'étude.

Tous les sujets présentant des événements indésirables - qu'ils soient considérés comme associés à l'utilisation du traitement à l'étude ou non - seront surveillés jusqu'à ce que les symptômes disparaissent et que toute valeur de laboratoire anormale soit revenue à la ligne de base, ou jusqu'à ce qu'il y ait une explication satisfaisante des changements observés, ou jusqu'au décès , auquel cas un rapport pathologique complet d'un pathologiste qualifié sera fourni. Tous les résultats doivent être signalés sur une page "événement indésirable" dans le formulaire d'enregistrement de cas.

Tous les événements indésirables seront signalés et documentés comme décrit ci-dessous. Les événements indésirables sont divisés en catégories « graves » et « non graves ». Cela détermine la procédure qui doit être utilisée pour signaler/documenter l'événement indésirable (voir ci-dessous).

6.1 Définition des événements indésirables graves et non graves

Un événement indésirable grave est :

• Tout événement mortel ou mettant la vie en danger
• Tout événement qui désactive de façon permanente
• Tout événement nécessitant ou prolongeant une hospitalisation
• Tout événement impliquant un cancer, une anomalie congénitale ou résultant d'un surdosage (application d'une dose supérieure à la dose stipulée).

Les événements indésirables qui n'entrent pas dans ces catégories sont définis comme non graves.

6.2 Évaluation de la gravité de l'EI

Quelle que soit la classification d'un événement indésirable comme grave ou non grave (voir ci-dessus), sa gravité doit être évaluée comme légère, modérée ou sévère, selon les seuls critères médicaux :

Léger = n'interfère pas avec les activités de routine, acceptable Modéré = interfère avec les activités de routine Sévère = impossible d'effectuer les activités de routine, considéré comme inacceptable par le médecin, nécessite un traitement, nécessite l'arrêt de l'étude ou a un effet résiduel.

Il convient de noter qu'un événement indésirable grave n'a pas besoin d'être de nature grave. Quelle que soit leur gravité, tous les événements indésirables graves doivent être signalés comme indiqué ci-dessous.

6.3 Notification/documentation des événements indésirables Les événements indésirables sont collectés par notification spontanée. 6.3.1 Déclaration/documentation des événements indésirables graves Tous les événements indésirables graves survenus au cours de cette étude, qu'ils soient considérés comme associés à l'étude ou non, doivent être documentés sur une page « Événement indésirable » dans le formulaire d'enregistrement de cas.

Un rapport de suivi comprenant toutes les nouvelles informations obtenues sur l'événement grave doit être préparé et sera recueilli.

L'investigateur remettra sur demande des copies de tous ces rapports au comité d'éthique. Le cas échéant, les enquêteurs informeront les autorités.

6.3.2 Notification/documentation des événements indésirables non graves Ceux-ci sont à documenter sur une page « Événement indésirable » dans le formulaire d'enregistrement de cas.

7 Analyse statistique Ces analyses chercheront à explorer les éventuelles différences statistiquement significatives dans les trajectoires longitudinales des cytokines nasales entre les individus sains, les individus atopiques et les asthmatiques. Nous allons d'abord entreprendre des statistiques descriptives de base. Caractéristiques du sujet (par ex. état de santé, variables démographiques) et variables de résultat (par ex. libération nasale de cytokines, réponses cliniques) seront décrites en calculant le maximum, le minimum, la médiane, la moyenne et l'écart-type pour les variables métriques et les fréquences absolues et relatives pour les variables catégorielles pour chaque groupe de sujets (individus sains, individus atopiques et asthmatiques).

Les changements de journal par rapport à la ligne de base seront comparés entre les groupes et à chaque instant à l'aide de tests t pour chaque comparaison par paires entre les groupes, afin d'explorer la forme des trajectoires au fil du temps. À des fins d'illustration graphique, les trajectoires individuelles de changement de ligne de base de chaque patient seront tracées ainsi que les moyennes de groupe avec des IC à 95 %.

Si les changements logarithmiques par rapport à la ligne de base présentent une linéarité raisonnable, nous testerons une association entre les groupes de sujets et les trajectoires longitudinales en utilisant des modèles linéaires mixtes avec des interceptions aléatoires spécifiques au sujet pour tenir compte des corrélations intra-individuelles des mesures répétées, et grouper par termes d'interaction temporelle pour tester les différences statistiquement significatives dans les trajectoires. La motivation de cette approche de modélisation mixte sera d'augmenter la puissance en combinant des informations sur plusieurs points dans le temps. Les trajectoires moyennes et les IC à 95 % déduits par le travail de modélisation mixte seront également tracés

8 Aspects éthiques et juridiques L'étude sera réalisée dans le respect des exigences légales locales et des BPC. Elle sera réalisée conformément aux directives de la Déclaration d'Helsinki (1964), y compris les révisions en vigueur.

8.1 Consentement éclairé du sujet Avant d'être admis à l'étude, le sujet doit avoir consenti à participer après que la nature, la portée et les conséquences possibles de l'étude clinique lui aient été expliquées sous une forme compréhensible pour lui. Le sujet doit donner son consentement par écrit. La signature de l'investigateur confirmera le consentement du sujet. Le patient peut retirer son consentement, même sans faire de commentaires, à tout moment et sans conséquences négatives pour ses soins médicaux futurs. Des échantillons de nasosorption et/ou d'ARN et/ou de sang peuvent être envoyés sous une forme anonyme à des partenaires de collaboration en dehors de l'Autriche pour analyse (par ex. analyse de l'IL-33 clivée et entière par AstraZeneca, Cambridge UK). Le patient en est informé dans le formulaire de consentement éclairé.

8.2 Reconnaissance/approbation de l'étude Avant le début de l'étude, le protocole d'étude sera soumis au comité d'éthique de l'université de médecine de Vienne et de l'hôpital général de Vienne (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Vienne, Autriche).

8.3 Assurance Tous les sujets participant à cette étude seront assurés auprès de la compagnie d'assurances de Zürich (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienne, tél. +43 50 1255 1255).

8.4 Confidentialité Tous les noms des sujets seront gardés secrets dans les dossiers des investigateurs. Les sujets seront identifiés tout au long de la documentation et de l'évaluation par le numéro qui leur est attribué au cours de l'étude. Les sujets seront informés que tous les résultats de l'étude seront stockés et traités dans la plus stricte confidentialité.

9 Documentation et utilisation des résultats de l'étude 9.1 Documentation des résultats de l'étude Tous les résultats recueillis au cours de l'étude seront rassemblés dans un fichier de données source et seront ensuite transférés dans les formulaires de rapport de cas (CRF). Toutes les inscriptions sur les formulaires d'enregistrement de cas seront faites lisiblement à l'encre noire ou bleue. Si des corrections sont apportées aux entrées dans le formulaire d'enregistrement de cas, les mots ou les chiffres seront entourés d'un cercle et d'un seul trait tracé à travers eux. La valeur correcte sera inscrite à côté de l'ancienne entrée et de la date et la correction sera paraphée. Les inscriptions incorrectes ne doivent pas être couvertes de liquide correcteur ou effacées ou rendues illisibles de quelque façon que ce soit. Les CRF remplis seront signés par l'investigateur. Les CRF seront remplis immédiatement après l'examen final. Les dossiers médicaux sur lesquels le CRF est basé seront conservés pendant au moins 15 ans.

9.2 Utilisation des résultats de l'étude Les résultats de cette étude seront publiés par les investigateurs dans une revue scientifique et présentés lors de réunions scientifiques. Le manuscrit sera distribué à tous les co-chercheurs avant d'être soumis.

10 Considérations sur les risques et avantages potentiels pour les participants à l'étude et sélection de la dose

Les participants inclus ne bénéficieront pas directement de l'étude. Cependant, comme la cinétique de la stimulation mécanique des muqueuses n'est pas encore complètement comprise, cette étude pilote complète fournira l'occasion d'orienter les recherches futures qui, espérons-le, conduiront à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Les risques potentiels pour les participants comprennent la douleur, l'infection et l'hématome au site du prélèvement sanguin. Lors du prélèvement de la muqueuse nasale et des sécrétions, un léger saignement nasal est un risque possible. Pendant le SPT, bien que hautement improbable, des réactions anaphylactiques sont possibles. Afin de minimiser le risque de réactions anaphylactiques et de fournir un traitement optimal en cas de réaction anaphylactique, les patients seront surveillés pendant au moins 30 minutes après la SPT. Lors de toutes les visites des participants, du personnel qualifié et des médicaments d'urgence seront disponibles à tout moment.