Kinetik af nasale cytokinresponser på mekanisk stimulering

Allergisk rhinitis (AR) og allergisk astma er almindelige manifestationer af type I-allergi, en IgE-medieret overfølsomhedssygdom, der anslås at påvirke så meget som 40 % af den globale befolkning. IgE produceres af B-celler og binder til overfladen af ​​mastceller og basofiler via dens højaffinitets-Fce-receptor I (FceRI). Tværbinding af overflade-IgE med dets specifikke allergen inducerer degranulering af cellerne såvel som frigivelse af inflammatoriske mediatorer. Denne proces, der udvikler sig over minutter, fører til de typiske okulære, nasale og pulmonale symptomer på AR og astma, såsom kløe, rødme af øjnene, løbende og/eller tilstoppet næse og hvæsende vejrtrækning på grund af luftindfangning som følge af obstruktion i nedre luftveje. Nogle patienter kan også udvikle senfasereaktioner (LPR). Disse reaktioner udvikler sig typisk 2-6 timer efter allergeneksponering, topper i intensitet mellem 6-9 timer og er for det meste karakteriseret ved vævsødem, der viser sig som luftstrømsobstruktion i luftvejene.

Siden introduktionen af ​​brugervenlige og højabsorberende anordninger til prøveudtagning af slimhindevæske, er mediatorerne involveret i de umiddelbare og sene fase allergiske reaktioner og kinetikken af ​​deres frigivelse blevet velkarakteriseret i løbet af de sidste par år. Indsats fra Imperial College London og upublicerede data fra efterforskergruppen i Wien har vist, at nøglemediatorer involveret i den umiddelbare fase inkluderer mastcelle-afledte mediatorer (Tryptase, PGD2), epitelalarminer (IL-33, sST2) og komplement (C3a) , C4a, C5a, D-Dimer). Mediatorer involveret i senfasereaktioner inkluderer også alarminer (sST2, TSLP), Th2-cytokiner (IL-4, IL-5, IL-13), neutrofile mediatorer (MMP-9) og eosinofile mediatorer (EDN).

Men hvad der også for nylig er blevet klart gennem placebokontrollerede undersøgelser er, at nogle mediatorer er mekanisk medierede (upublicerede observationer), idet de frigives til det ekstracellulære miljø som et resultat af selve prøvetagningsprocessen. Dette er af vital interesse, da forståelsen af, hvilke cytokiner der er mekaniske, og hvilke der er allergenspecifikke, vil hjælpe med at guide fremtidige undersøgelser, der forsøger at målrette specifikke biomarkører til behandling eller sygdomsovervågning. For at forstå, om den mekaniske frigivelse spiller nogen rolle i den patologiske reaktion på allergener, skal forskellige patientkohorter undersøges for at se, om deres reaktioner adskiller sig på nogen måde.

Undersøgelsens rationelle

I lyset af dette foreslår efterforskerne en undersøgelse for at undersøge virkningerne af slimhindeprøver på cytokinfrigivelse fra næseepitel. Efterforskerne planlægger at prøve forskellige patientkohorter (allergisk rhinitis, allergisk astma, ikke-allergisk) for at se, hvordan mekaniske effekter påvirkes af prøveudtagning og allergisk eller ikke-allergisk status. Ved at inkludere 10 patienter i hver gruppe håber efterforskerne at etablere en række "normale" for mekanisk frigivelse af allergenrelevante cytokiner i hver undersøgelsesgruppe, hvilket vil hjælpe med at informere fremtidige undersøgelser, der undersøger allergenspecifikke reaktioner. For at kortlægge både de symptomatiske og objektive reaktioner på luftvejsprøvetagning, vil symptomscore og luftvejsflowmålere blive anvendt. For at kortlægge reaktionernes kinetik vil deltagerne gennemgå et tidsforløb for slimhindeprøvetagning i løbet af en 8 timers periode på en enkelt dag. Da der ikke gives nogen interventionsstoffer, vil denne undersøgelse have en meget lav risiko for de involverede individer, samtidig med at den kaster vigtigt lys over de epiteliale reaktioner på mekanisk manipulation.

Undersøgelsesdesign I dette single-center, pilotstudie vil i alt 36 patienter (n=12 pr. gruppe) blive rekrutteret på frivillig basis og vil alle modtage næseprøver. Undersøgelsesdeltagere vil gennemgå næseprøven i et enkelt besøg.

Screeningsbesøg

Procedure:

• Underskrivelse af den informerede samtykkeformular
• Tildeling af screeningsnummer
• Demografiske data
• Historie om allergi
• Vurdering af in- og eksklusionskriterier
• Graviditetstest for kvinder, hvis der er behov for SPT
• Medicinsk historie
• Patienter, der rapporterer en historie med astma, skal fremlægge objektive beviser for luftvejsobstruktion og reversibilitet (spirometri reversibilitet eller PC20 methacholin/histamin <8mg)
• Samtidig medicinering
• Anterior rhinoskopi
• Standard SPT med kommercielt ekstrakt fra: hassel, aske, græsblanding, bynke, bynke, D. pteronyssinus, D. farina, katte- og hundeskæl, alternaria, cladosporium, histamin og negativ kontrol
• Blodprøvetagning (max 60 ml hepariniseret blod og serum) - En del af blodprøven sendes direkte til laboratoriet for analyse af total IgE og specifikt IgE til relevante allergener. Fra resten af ​​blodet vil RNA blive fremstillet og opbevaret ved -80°C og serum vil blive adskilt og opbevaret ved -20°C.
• næseprøveudtagning (slimhindekuretteprøvetagning og næsesekretprøve)

Prøvebesøg

Procedure:

• Revurdering af ind- og udelukkelseskriterier (allergenspecifikke IgE-resultater)
• Registrering af samtidig medicinering
• Baseline Blodprøvetagning
• Indsamling af baseline næseprøver for begge næsebor (prøveudtagning af nasal sekretion) efter 0 min
• Baseline TNSS-score
• Baseline PNIF
• Optagelse af uønskede hændelser (AE).

• Blod, PNIF, næseprøve (begge næsebor: mucosal curette prøvetagning og nasal sekretion prøvetagning) og TNSS score, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 120 min, 180 min, 240 min, 3600 min, 40 min, 40 min. af prøvetagningstidsforløbet

  4 Studieprocedurer

4.1 Deltagernes sygehistorie, demografiske data, samtidig medicin Deltagerne vil blive spurgt om deres sygehistorie, herunder demografiske data og samtidig medicinering, deres allergiske symptomer inklusive intensitet og varighed og deres allergiske medicinanamnese.

4.2 Anamnese med allergi og TNSS-score Deltagerne vil blive bedt om forekomst af nysen, rhinoré, nasal kløe, tilstoppet næse og om at gradere hvert symptom. De vil bruge følgende symptomscoremetode: 0 = fraværende; 1 = mild - til stede, men let tolereret; 2 = moderat - til stede, symptom er generende, men forstyrrer ikke dagligdags aktiviteter; 3 = alvorlig - symptom er svært at tolerere og forstyrrer dagligdagens aktiviteter.

4.3 Anterior rhinoskopi Anterior rhinoskopi vil blive udført én gang under screeningsbesøget for at udelukke anatomiske varianser (f.eks. septal deviation) eller patologiske ændringer (f.eks. næsepolypper). Det vil blive udført ved at bruge et spekulum med patienten siddende med hovedet lidt tilbage.

4.4 Peak Inspiratory Nasal Flow Meter (PNIF) Bærbarheden og letheden af ​​PNIF giver en unik mulighed for at opnå objektive målinger. Det er også for nylig blevet valideret som et undersøgelsesværktøj under nasal allergenudfordring.

4.4.1 Fremgangsmåde: PNIF'en bruger et rør med variabel diameter kalibreret direkte i liter pr. minut sammen med en indikatorring med lav inerti. Ringens position efter en inspiratorisk manøvre angiver det maksimale flow, der er opnået. Enheden fungerer, når en patient inhalerer gennem munden eller næsen, dette får luft til at blive trukket gennem måleren, og en markør bevæger sig langs skalaen for at angive inhalationshastigheden. Den opnåede flowhastighed kan noteres ved at kontrollere cursorens position i forhold til den kalibrerede skala.

4.4.2 PNIF i undersøgelsesgennemførelse: Deltagerne vil blive trænet i at bruge PNIF på undersøgelsesdagen, og derefter vil det blive brugt på alle undersøgelsestidspunkter for at få information om nasal flow.

4.5 Hudpriktest 4.5.1 Fremgangsmåde: Allergener indsættes i underarmens dermis ved forsigtigt at prikke huden gennem en dråbe (20 ul) af en allergenholdig opløsning med en steril lancet med mindst 2 cm mellem hvert enkelt påføringspunkt. 0,9 % natriumchloridopløsning vil blive brugt som negativ og histamin som positiv kontrol. Hos tidligere sensibiliserede individer vil kløende hævelse og en rødme af huden (hvid- og flarereaktion) forekomme inden for 15 minutter efter udsættelse for det respektive allergen. Efter 20 minutter vil allergenopløsninger blive tørret af, og randene af svalerne vil blive sporet med en kuglepen. Gennemsigtig tape vil blive klæbet på huden for at overføre omridset af wheal til tapen til optegnelserne. Overfladen af ​​hvalerne vil blive beregnet ved digital planimetri. For inklusion vil hvaler på mindst 3 mm i diameter blive betragtet som positive reaktioner.

4.5.2 Testløsninger: Et kommercielt tilgængeligt panel af træ- og græspollen, ukrudts- og flerårige allergener (Allergopharma, Wien, Østrig) vil blive brugt ved screeningsbesøget og vil blive opbevaret i henhold til producentens anvisninger. Som kontroller vil steril 0,9% NaCl-opløsning (negativ kontrol) og histamin (positiv kontrol, Allergopharma, Wien, Østrig) blive brugt. De vil blive opbevaret i henhold til producentens anvisninger.

4.5.3 SPT i studiegennemførelse:

Screeningsbesøg:

En standard hudpriktest med kommercielt birkepollenekstrakt og et panel af træ- og græspollen, ukrudts- og flerårige allergener (alle Allergopharma, Wien, Østrig) som anvendt i rutinediagnostik i ØNH-afdelingens allergiklinik vil blive udført for at vurdere deltagernes sensibiliseringsprofil ved screeningsbesøget.

4.5.4 Sikkerhedsforanstaltninger Som en sikkerhedsforanstaltning vil deltagerne blive overvåget i 30 minutter efter test. Alle undersøgelser vil blive foretaget i ØNH-afdelingens ambulatorium, hvor fuldt akutudstyr er tilgængeligt.

4.6 Blodprøvetagning og måling af immunologiske parametre Blodprøver vil blive udtaget ved screeningsbesøget og ved alle undersøgelsesbesøg ved punktering af den antecubitale vene før hudtest. Et maksimum på 60 ml pr. besøg vil blive taget enten hepariniseret (f.eks. til basofile følsomhedsassays) eller til fremstilling af serum (f.eks. til vurdering af total- og allergenspecifikke immunoglobulinniveauer eller RBL-assay). Serumhætteglas vil blive behandlet, og serum vil blive opbevaret ved -20°C. Allergenspecifik IgE af blodprøver fra screeningsbesøget vil blive målt af CAP-FEIA for at vurdere den allergenspecifikke RAST-klasse for patienterne. Måling af total, fri og allergenspecifik serum IgE, IgG, IgA og IgM udføres enten ved CAP-FEIA, ved mikroarraymåling eller ELISA. Immunmediatorer vil blive målt ved hjælp af MSD-platformen enten af ​​os eller af vores samarbejdspartnere i AstraZeneca, Cambridge, Storbritannien. Målingen vil blive udført i slutningen af ​​undersøgelsen i alle indsamlede serumprøver for at minimere interassayvariation.

4.7 Graviditetstest Hos kvindelige deltagere vil graviditet blive udelukket med en standard uringraviditetstest. Testen vil blive udført før den første hudpriktest ved screeningsbesøget og efterfølgende en gang om måneden.

4.8 Næseprøvetagning Næseprøvetagning vil blive udført ved alle besøg. For hvert besøg vil der blive indsamlet prøver ved hjælp af nasosorption FXi/PU (indeholder en syntetisk absorberende matrix (SAM)) eller en 10 cm lang plastikcurette (nasosorptionsenheder fra Hunt Developments, UK) (Curette-enheder fra Arlington Scientific, USA)

4.8.1 Nasosorption ved hjælp af FXi/PU (Hunt Developments, UK). Under visualisering vil enheden blive indsat i næsehulen og blive placeret langs sidevæggen mod den nedre turbinat. Patientens pegefinger vil blive brugt til at trykke på de ydre aspekter af alarmen og laterale næsebrusk for at holde enheden på plads. Efter 1 minut vil enhederne blive fjernet og derefter frosset ved -80°C.

4.8.2 Slimhinde-mRNA-prøvetagning En 10 cm nasal curette (enten Rhino-Probe, Arlington Scientific, USA eller Cellskim, Hunt Developments, UK) vil blive brugt. Under direkte visualisering vil curetten blive bragt til at ligge mod den midterste del af den inferiøre turbinat. Curetten vil blive presset mod slimhinden bevæget udad 2-3 gange. Denne bevægelse gentages 2-3 gange for at sikre god prøveopsamling. Denne curette og teknik har vist sig ikke at forårsage væsentligt ubehag for deltagerne, og den har derfor den fordel, at der ikke er behov for lokalbedøvelse. Efter opsamling vil cellerne blive lyseret i Qiagen RLT-buffer og opbevaret ved -80°C til senere mRNA-analyse.

5 Undersøgelsesprodukter og undersøgelsesmedicin 5.3 Samtidig medicinering 5.3.1 Generelt Al yderligere medicin, der tages af forsøgspersonerne ved indgangen til undersøgelsen eller på et hvilket som helst tidspunkt under undersøgelsen, betragtes som samtidig medicinering og vil blive dokumenteret i CRF. Samtidig medicin bør holdes på et minimum under undersøgelsen, men hvis det anses for nødvendigt, kan det gives, hvis det ikke forstyrrer undersøgelsesprotokollen.

5.3.2 Redningsmedicin Selvom anafylaktiske hændelser er meget usandsynlige i denne undersøgelse, skal de altid betragtes som mulige. Derfor vil et komplet nødsæt være tilgængeligt med det samme i tilfælde af anafylaktiske reaktioner ved SPT. Desuden, hvis deltageren lider af stærke hudsymptomer efter SPT vil desloratadin 5mg blive givet for at lindre symptomerne.

5.3.3 Forbudt samtidig medicinering

Forsøgspersoner skal holde sig fra medicin, der forstyrrer undersøgelsesprocedurerne, så længe undersøgelsen varer. Følgende samtidige behandlinger er ikke tilladt under denne undersøgelse:

• Systemiske eller topiske kortikosteroider
• Andre immunsuppressive lægemidler
• Antihistaminer eller dinatriumkromoglycat 3 dage før screeningsbesøget
• Systemiske eller intranasale adrenerge lægemidler
• Psykofarmakologiske lægemidler

• ACE-hæmmere eller betablokkere

  6 Uønskede hændelser En uønsket hændelse er enhver hændelse under en klinisk undersøgelse, inklusive interkurrent sygdom eller ulykke, som forringer forsøgspersonens velbefindende; det kan også tage form af en unormal laboratorieværdi. Udtrykket uønsket hændelse indebærer ikke en årsagssammenhæng med undersøgelsesbehandlingen.

Alle forsøgspersoner, der oplever uønskede hændelser - uanset om de anses for at være forbundet med brugen af ​​undersøgelsesbehandlingen eller ej - vil blive overvåget, indtil symptomerne aftager, og enhver unormal laboratorieværdi er vendt tilbage til baseline, eller indtil der er en tilfredsstillende forklaring på de observerede ændringer, eller indtil døden. , i hvilket tilfælde en fuldstændig patologirapport fra en kvalificeret patolog vil blive leveret. Alle fund skal rapporteres på en "uønsket hændelse"-side i sagsjournalen.

Alle uønskede hændelser vil blive rapporteret om og dokumenteret som beskrevet nedenfor. Bivirkninger er opdelt i kategorierne "alvorlige" og "ikke-alvorlige". Dette bestemmer den procedure, der skal anvendes til at rapportere/dokumentere den uønskede hændelse (se nedenfor).

6.1 Definition af alvorlige og ikke-alvorlige bivirkninger

En alvorlig bivirkning er:

• Enhver hændelse, der er dødelig eller livstruende
• Enhver begivenhed, der er permanent deaktiverende
• Enhver hændelse, der kræver eller forlænger hospitalsindlæggelse
• Enhver hændelse, der involverer kræft, medfødt abnormitet eller opstår som følge af overdosering (anvendelse af mere end den fastsatte dosis).

Bivirkninger, der ikke falder ind under disse kategorier, defineres som ikke-alvorlige.

6.2 Vurdering af sværhedsgraden af ​​AE

Uanset klassificeringen af ​​en uønsket hændelse som alvorlig eller ikke-alvorlig (se ovenfor), skal dens sværhedsgrad vurderes som mild, moderat eller alvorlig alene i henhold til medicinske kriterier:

Mild = forstyrrer ikke rutineaktiviteter, acceptabel Moderat = forstyrrer rutineaktiviteter Alvorlig = umulig at udføre rutineaktiviteter, betragtes som uacceptabel af lægen, kræver behandling, kræver afbrydelse af undersøgelsen eller har resteffekt.

Det skal bemærkes, at en alvorlig bivirkning ikke behøver at være alvorlig. Uanset sværhedsgrad skal alle alvorlige bivirkninger rapporteres som nedenfor.

6.3 Indberetning/dokumentation af utilsigtede hændelser Bivirkninger indsamles ved spontan indberetning. 6.3.1 Rapportering/dokumentation af alvorlige uønskede hændelser Alle alvorlige uønskede hændelser, som opstår i løbet af denne undersøgelse, uanset om de anses for at være forbundet med undersøgelsen eller ej, skal dokumenteres på en "Uønskede hændelse"-side i sagsjournalen.

Der skal udarbejdes en opfølgningsrapport med alle indhentede nye oplysninger om den alvorlige hændelse, som vil blive indsamlet.

Efterforskeren vil på anmodning indsende kopier af alle disse rapporter til den etiske komité. Hvor det er nødvendigt, vil efterforskerne informere myndighederne.

6.3.2 Indberetning/dokumentation af ikke-alvorlige utilsigtede hændelser Disse skal dokumenteres på en side "Uønskede hændelser" i sagsjournalen.

7 Statistisk analyse Disse analyser vil søge at udforske eventuelle statistisk signifikante forskelle i longitudinelle nasale cytokinbaner mellem raske individer, atopiske individer og astmatikere. Vi vil først foretage grundlæggende beskrivende statistik. Emnets karakteristika (f.eks. sundhedstilstand, demografiske variabler) og udfaldsvariable (f.eks. nasal cytokinfrigivelse, kliniske responser) vil blive beskrevet ved at beregne maksimum, minimum, median, middel og standardafvigelse for metriske variable og absolutte og relative frekvenser for kategoriske variable for hver faggruppe (raske personer, atopiske personer og astmatikere).

Log-ændringer fra baseline vil blive sammenlignet mellem grupper og på hvert tidspunkt ved hjælp af t-tests for hver parvis sammenligning mellem grupper, for at udforske formen af-baner-over-tid. Til grafisk illustration vil de individuelle log-baseline-ændringsbaner for hver patient blive plottet såvel som gruppemiddelværdier med 95 % CI'er.

Hvis log-ændringer-fra-baseline-udviser rimelig-linearitet, vil vi teste for en sammenhæng mellem emnegrupper og longitudinelle baner ved hjælp af blandede lineære modeller med emnespecifikke tilfældige opsnapninger for at tage højde for intra-individuelle korrelationer af gentagne mål, og gruppere efter tidsinteraktionsbegreber for at teste for statistisk signifikante forskelle i baner. Motivationen for denne blandede modelleringstilgang vil være at øge kraften ved at kombinere information på tværs af flere tidspunkter. Gennemsnitlige baner og 95 % CI'er som udledt af det blandede modelleringsarbejde vil også blive plottet

8 Etiske og juridiske aspekter Undersøgelsen vil blive udført i overensstemmelse med lokale lovkrav og GCP. Det vil blive udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Helsinki-erklæringen (1964), herunder aktuelle revisioner.

8.1 Informeret samtykke fra forsøgsperson Inden forsøgspersonen optages i undersøgelsen, skal forsøgspersonen have givet sit samtykke til at deltage, efter at arten, omfanget og de mulige konsekvenser af den kliniske undersøgelse er blevet forklaret i en for ham/hende forståelig form. Forsøgspersonen skal give skriftligt samtykke. Efterforskerens underskrift bekræfter forsøgspersonens samtykke. Patienten kan til enhver tid trække samtykket tilbage, selv uden at give kommentarer, uden negative konsekvenser for hans fremtidige lægebehandling. Nasosorption og/eller RNA- og/eller blodprøver kan sendes i anonymiseret form til samarbejdspartnere uden for Østrig til analyse (f.eks. analyse af spaltet og hel IL-33 af AstraZeneca, Cambridge UK). Patienten oplyses herom i samtykkeerklæringen.

8.2 Anerkendelse/godkendelse af undersøgelsen Inden undersøgelsens start vil undersøgelsesprotokollen blive forelagt den etiske komité for det medicinske universitet i Wien og det generelle hospital i Wien (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Wien, Østrig).

8.3 Forsikring Alle forsøgspersoner, der deltager i denne undersøgelse, vil være forsikret hos Zürich Insurance Company (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Wien, Tlf. +43 50 1255 1255).

8.4 Fortrolighed Alle forsøgspersoners navne vil blive holdt hemmelige i efterforskernes arkiver. Forsøgspersoner vil blive identificeret i hele dokumentationen og evalueringen ved det antal, de har fået tildelt under undersøgelsen. Forsøgspersonerne vil få at vide, at alle undersøgelsesresultater vil blive opbevaret og håndteret strengt fortroligt.

9 Dokumentation og brug af undersøgelsesresultater 9.1 Dokumentation af undersøgelsesresultater Alle resultater indsamlet i løbet af undersøgelsen vil blive samlet i en kildedatafil og vil senere blive overført til caserapportformularerne (CRF'erne). Alle indtastninger på sagsjournalen vil være læseligt med sort eller blå blæk. Hvis der rettes til indtastninger i sagsjournalen, vil ordene eller tallene blive ringet op, og der trækkes et enkelt streg igennem dem. Den korrekte værdi vil blive indtastet ved siden af ​​den gamle indtastning og dato, og rettelsen vil blive initialiseret. Forkerte indtastninger må ikke dækkes med korrektionsvæske eller udslettes eller gøres ulæselige på nogen måde. De udfyldte CRF'er vil blive underskrevet af investigator. CRF'er vil blive afsluttet umiddelbart efter den afsluttende eksamen. De lægejournaler, som CRF er baseret på, opbevares i mindst 15 år.

9.2 Brug af undersøgelsesresultaterne Resultaterne af denne undersøgelse vil blive offentliggjort af efterforskerne i et videnskabeligt tidsskrift og præsenteret på videnskabelige møder. Manuskriptet vil blive rundsendt til alle medforskere inden indsendelse.

10 overvejelser om potentielle risici og fordele for undersøgelsesdeltagere og valg af dosis

De inkluderede deltagere vil ikke få direkte gavn af undersøgelsen. Men da kinetikken af ​​mekanisk slimhindestimulering stadig ikke er fuldstændig forstået, vil denne omfattende pilotundersøgelse give mulighed for at vejlede fremtidig forskning, som forhåbentlig vil føre til opdagelsen af ​​nye terapeutiske mål.

Potentielle risici for deltagerne omfatter smerte, infektion og hæmatom på stedet for blodudtagning. Under næseslimhinden og sekretprøvetagning er let næseblødning en mulig risiko. Under SPT, selvom det er meget usandsynligt, er anafylaktiske reaktioner en mulighed. For at minimere risikoen for anafylaktiske reaktioner og for at give optimal behandling i tilfælde af at en anafylaktisk reaktion skulle opstå, vil patienterne blive monitoreret i minimum 30 minutter efter SPT. Ved alle deltagerbesøg vil uddannet personale og akutmedicin være tilgængelig hele tiden.