Kinetika odpovědí nosních cytokinů na mechanickou stimulaci

Alergická rýma (AR) a alergické astma jsou běžnými projevy alergie I. typu, onemocnění z přecitlivělosti zprostředkované IgE, které podle odhadů postihuje až 40 % celosvětové populace. IgE je produkován B buňkami a váže se na povrch žírných buněk a bazofilů prostřednictvím svého vysokoafinitního Fce receptoru I (FceRI). Síťování povrchového IgE jeho specifickým alergenem indukuje degranulaci buněk a také uvolnění zánětlivých mediátorů. Tento proces, který se vyvíjí během několika minut, vede k typickým očním, nazálním a plicním symptomům AR a astmatu, jako je svědění, zarudnutí očí, rýma a/nebo ucpaný nos a sípání v důsledku zachycování vzduchu v důsledku obstrukce dolních dýchacích cest. U některých pacientů se také mohou vyvinout reakce pozdní fáze (LPR). Tyto odezvy se typicky vyvíjejí 2-6 hodin po expozici alergenu, vrcholí v intenzitě mezi 6-9 hodinami a jsou většinou charakterizovány edémem tkáně, který se projevuje jako obstrukce proudění vzduchu v dýchacích cestách.

Od zavedení snadno použitelných a vysoce absorpčních zařízení pro odběr vzorků slizniční tekutiny se během několika posledních let dobře charakterizovaly mediátory zapojené do okamžité a pozdní fáze alergických reakcí a kinetika jejich uvolňování. Úsilí Imperial College London a nepublikovaná data ze skupiny výzkumníků ve Vídni ukázaly, že mezi klíčové mediátory zapojené do bezprostřední fáze patří mediátory odvozené od žírných buněk (tryptáza, PGD2), epiteliální alarminy (IL-33, sST2) a komplement (C3a). C4a, C5a, D-dimer). Mezi mediátory zapojené do reakcí pozdní fáze patří také alarminy (sST2, TSLP), Th2 cytokiny (IL-4, IL-5, IL-13), neutrofilní mediátory (MMP-9) a eozinofilní mediátory (EDN).

Co se však také nedávno ukázalo prostřednictvím placebem kontrolovaných studií, je to, že některé mediátory jsou zprostředkovány mechanicky (nepublikovaná pozorování) a jsou uvolňovány do extracelulárního prostředí jako výsledek samotného procesu odběru vzorků. To je životně důležité, protože pochopení toho, které cytokiny jsou mechanické a které jsou specifické pro alergen, pomůže vést budoucí studie pokoušející se zacílit na specifické biomarkery pro léčbu nebo monitorování onemocnění. Abychom pochopili, zda mechanické uvolňování hraje nějakou roli v patologické reakci na alergeny, bude nutné prozkoumat různé kohorty pacientů, aby se zjistilo, zda se jejich reakce nějakým způsobem liší.

Zdůvodnění studie

Ve světle toho výzkumníci navrhují studii, která by zkoumala účinky odebírání vzorků ze sliznice na uvolňování cytokinů z nosního epitelu. Výzkumníci plánují odebrat vzorky různých kohort pacientů (alergická rýma, alergické astma, nealergickí), aby viděli, jak jsou mechanické účinky ovlivněny odběrem vzorků a alergickým nebo nealergickým stavem. Zahrnutím 10 pacientů do každé skupiny vědci doufají, že se jim podaří stanovit rozsah „normálního“ mechanického uvolňování cytokinů relevantních pro alergeny v každé studijní skupině, což pomůže informovat budoucí studie zkoumající alergen specifické reakce. Aby bylo možné zmapovat jak symptomatickou, tak objektivní odezvu na odběr vzorků z dýchacích cest, bude použito skóre příznaků a průtokoměry v dýchacích cestách. Aby se zmapovala kinetika odpovědí, účastníci podstoupí časový průběh odběru vzorků sliznice v průběhu 8hodinového období jednoho dne. Vzhledem k tomu, že nejsou podávány žádné intervenční látky, bude tato studie nést velmi nízké riziko pro zúčastněné jedince a zároveň vrhá důležité světlo na epiteliální reakce na mechanickou manipulaci.

Uspořádání studie V této pilotní studii s jediným centrem bude dobrovolně přijato celkem 36 pacientů (n=12 na skupinu) a všem bude odebrán nazální odběr. Účastníci studie podstoupí odběr vzorků z nosu při jediné návštěvě.

Screeningová návštěva

Postup:

• Podepsání formuláře informovaného souhlasu
• Přidělení čísla screeningu
• Demografická data
• Historie alergie
• Posouzení kritérií pro zařazení a vyloučení
• Těhotenský test pro ženy, pokud vyžadují SPT
• Zdravotní historie
• Pacienti, kteří uvádějí v anamnéze astma, budou muset poskytnout objektivní důkazy o obstrukci a reverzibilitě dýchacích cest (reverzibilita spirometrie nebo PC20 metacholin/histamin < 8 mg)
• Souběžná medikace
• Přední rinoskopie
• Standardní SPT s komerčním extraktem z: lísky, jasanu, travní směsi, ambrózie, pelyňku, D. pteronyssinus, D. farina, kočičí a psí srsti, alternaria, cladosporia, histaminu a negativní kontroly
• Odběr krve (max 60ml heparinizované krve a séra) - Část krevního vzorku bude odeslána přímo do laboratoře k analýze celkového IgE a specifických IgE na příslušné alergeny. Ze zbytku krve bude RNA připravena a skladována při -80°C a sérum bude separováno a skladováno při -20°C.
• odběry z nosu (odběry slizniční kyrety a odběry nosního sekretu)

Návštěva odběru vzorků

Postup:

• Přehodnocení vstupních a vylučovacích kritérií (výsledky alergen-specifických IgE)
• Záznam souběžné medikace
• Základní odběr krve
• Základní odběr nosního vzorku pro obě nosní dírky (odběr vzorků z nosního sekretu) v 0 min
• Základní skóre TNSS
• Základní PNIF
• Záznam nežádoucích událostí (AE).

• Krev, PNIF, odběr z nosu (obě nosní dírky: odběr slizniční kyrety a odběr vzorků z nosního sekretu) a skóre TNSS, 15 minut, 30 minut, 45 minut, 60 minut, 75 minut, 90 minut, 120 minut, 180 minut, 240 minut, 300 minut, 4260 minut po 4260 minutách, časového průběhu vzorkování

  4 Studijní postupy

4.1 Zdravotní anamnéza účastníků, demografické údaje, souběžná medikace Účastníci budou požádáni o jejich anamnézu včetně demografických údajů a souběžné medikace, jejich alergické symptomy včetně intenzity a trvání a jejich anamnézu alergické medikace.

4.2 Alergická anamnéza a skóre TNSS Účastníci budou dotázáni na výskyt kýchání, rinorey, svědění nosu, ucpaného nosu a na klasifikaci každého symptomu. Budou používat následující metodu skóre symptomů: 0 = chybí; 1 = mírná – přítomná, ale snadno tolerovatelná; 2 = střední – přítomný, symptom je obtěžující, ale nenarušuje každodenní činnosti; 3 = závažný – symptom je obtížně tolerovatelný a zasahuje do každodenních činností.

4.3 Přední rinoskopie Přední rinoskopie bude provedena jednou během screeningové návštěvy, aby se vyloučily anatomické odchylky (např. odchylka septa) nebo patologické změny (např. nosní polypy). Provede se pomocí zrcátka s pacientem posazeným s hlavou mírně vzad.

4.4 Měřič maximálního inspiračního nosního průtoku (PNIF) Přenosnost a snadnost PNIF poskytuje jedinečnou příležitost k získání objektivních měření. Nedávno byla také ověřena jako studijní nástroj během nazálního alergenu.

4.4.1 Postup: PNIF používá trubici s proměnným průměrem kalibrovanou přímo v litrech za minutu spolu s indikačním kroužkem nízké setrvačnosti. Poloha kroužku po inspiračním manévru udává maximální dosažený průtok. Zařízení funguje, když pacient vdechuje ústy nebo nosem, což způsobí nasávání vzduchu přes měřič a kurzor se pohybuje po stupnici, aby ukazoval rychlost inhalace. Dosažený průtok lze zaznamenat kontrolou polohy kurzoru vůči kalibrované stupnici.

4.4.2 PNIF v průběhu studie: Účastníci budou vyškoleni, jak používat PNIF v den studie a poté bude použit ve všech časových bodech studie k získání informací o nazálním průtoku.

4.5 Kožní prick test 4.5.1 Postup: Alergeny se vpravují do dermis předloktí jemným propíchnutím kůže přes kapku (20 ul) roztoku obsahujícího alergen sterilní lancetou s minimálně 2 cm mezi každým jednotlivým bodem aplikace. 0,9% roztok chloridu sodného bude použit jako negativní a histamin jako pozitivní kontrola. U dříve senzibilizovaných jedinců se do 15 minut po expozici příslušným alergenem objeví svědivé otoky a zarudnutí kůže (reakce pupínků a vzplanutí). Po 20 minutách se roztoky alergenů setřou a okraje šrámů se obkreslí kuličkovým perem. Průhledná páska bude nalepena na kůži, aby se obrys pupínky přenesl na pásku pro záznamy. Povrch šrámů bude vypočítán pomocí digitální planimetrie. Pro zahrnutí budou za pozitivní reakce považovány pupeny o průměru alespoň 3 mm.

4.5.2 Testovací roztoky: Při screeningové návštěvě bude použit komerčně dostupný panel pylu stromů a trav, alergenů plevelů a trvalek (Allergopharma, Vídeň, Rakousko), který bude skladován podle pokynů výrobce. Jako kontroly bude použit sterilní 0,9% roztok NaCl (negativní kontrola) a histamin (pozitivní kontrola, Allergopharma, Vídeň, Rakousko). Budou skladovány podle pokynů výrobce.

4.5.3 SPT při provádění studie:

Prohlídka:

K posouzení bude proveden standardní kožní prick test s komerčním extraktem z pylu břízy a panelem pylu stromů a trav, plevelů a vytrvalých alergenů (vše Allergopharma, Vídeň, Rakousko) používaný v běžné diagnostice na alergologické klinice ORL oddělení. profil senzibilizace účastníků při screeningové návštěvě.

4.5.4 Bezpečnostní opatření Jako bezpečnostní opatření budou účastníci po testování sledováni po dobu 30 minut. Veškerá vyšetření budou prováděna na ambulanci ORL oddělení, kde je k dispozici kompletní pohotovostní vybavení.

4.6 Odběr krve a měření imunologických parametrů Vzorky krve budou odebírány při screeningové návštěvě a při všech studijních návštěvách punkcí antekubitální žíly před kožním testováním. Na jednu návštěvu bude odebráno maximálně 60 ml buď heparinizovaných (např. pro testy citlivosti bazofilů) nebo pro přípravu séra (např. pro hodnocení celkových a alergen specifických hladin imunoglobulinu nebo RBL test). Lahvičky séra budou zpracovány a sérum bude skladováno při -20°C. Alergen-specifické IgE vzorků krve ze screeningové návštěvy budou měřeny pomocí CAP-FEIA, aby se vyhodnotila alergen-specifická RAST-třída pacientů. Měření celkových, volných a alergen-specifických sérových IgE, IgG, IgA a IgM bude provedeno buď pomocí CAP-FEIA, měřením microarray nebo ELISA. Imunitní mediátory budou měřeny pomocí platformy MSD buď námi, nebo našimi spolupracovníky z AstraZeneca, Cambridge, UK. Měření bude provedeno na konci studie ve všech odebraných vzorcích séra, aby se minimalizovaly rozdíly mezi testy.

4.7 Těhotenský test U žen bude těhotenství vyloučeno standardním těhotenským testem z moči. Test bude proveden před prvním kožním prick testem při screeningové návštěvě a poté jednou měsíčně.

4.8 Odběr nosního vzorku Odběr nosního vzorku bude prováděn při všech návštěvách. Při každé návštěvě budou vzorky odebírány pomocí nasosorpce FXi/PU (obsahující syntetickou absorpční matrici (SAM)) nebo 10 cm dlouhé plastové kyrety (nasosorpční zařízení od Hunt Developments, UK) (kyretová zařízení od Arlington Scientific, USA)

4.8.1 Nasosorpce pomocí FXi/PU (Hunt Developments, UK). Při vizualizaci bude zařízení zavedeno do nosní dutiny a umístěno podél laterální stěny proti dolní mulčnici. Ukazováček pacienta se použije k přitlačení na vnější části alárních a laterálních nosních chrupavek, aby se zařízení udrželo na místě. Po 1 minutě budou zařízení vyjmuta a poté zmrazena na -80°C.

4.8.2 Odběr slizniční mRNA Bude použita 10cm nosní kyreta (buď Rhino-Probe, Arlington Scientific, USA nebo Cellskim, Hunt Developments, UK). Pod přímou vizualizací bude kyreta přiložena tak, aby ležela proti střední dolní části dolní turbinátu. Kyreta se 2-3krát přitlačí na povrch sliznice posunutý směrem ven. Tento pohyb se bude opakovat 2-3krát, aby se zajistil dobrý odběr vzorku. Ukázalo se, že tato kyreta a technika nezpůsobují účastníkům žádné významné nepohodlí, a proto má výhodu v tom, že nevyžaduje lokální anestetikum. Po odběru budou buňky lyžovány v pufru Qiagen RLT a uloženy při -80 °C pro pozdější analýzu mRNA.

5 Zkoumané produkty a studovaná medikace 5.3 Souběžná medikace 5.3.1 Obecně Veškerá další medikace užívaná subjekty při vstupu do studie nebo kdykoli během studie se považuje za souběžnou medikaci a bude zdokumentována v CRF. Souběžná medikace by měla být během studie omezena na minimum, ale pokud je to považováno za nutné, může být podána, pokud neinterferuje s protokolem studie.

5.3.2 Záchranná medikace Ačkoli jsou anafylaktické příhody v této studii velmi nepravděpodobné, vždy je nutné je považovat za možné. Proto bude okamžitě k dispozici kompletní pohotovostní sada pro případ anafylaktických reakcí při SPT. Kromě toho, pokud účastník trpí silnými kožními příznaky po SPT, bude mu poskytnut desloratadin 5 mg ke zmírnění příznaků.

5.3.3 Zakázané souběžné podávání léků

Subjekty musí po dobu trvání studie zůstat bez léků, které interferují s postupy studie. Během této studie nejsou povoleny následující souběžné léčby:

• Systémové nebo topické kortikosteroidy
• Jiné imunosupresivní léky
• Antihistaminika nebo kromoglykát disodný 3 dny před screeningovou návštěvou
• Systémové nebo intranazální adrenergní léky
• Psychofarmakologické léky

• ACE-inhibitory nebo beta-blokátory

  6 Nežádoucí příhody Nežádoucí příhoda je jakákoli příhoda během klinické studie, včetně interkurentního onemocnění nebo nehody, která zhoršuje pohodu subjektu; může mít také podobu abnormální laboratorní hodnoty. Termín nežádoucí příhoda neimplikuje kauzální vztah se studovanou léčbou.

Všichni jedinci, u kterých se vyskytly nežádoucí příhody – ať už jsou považovány za spojené s použitím studijní léčby či nikoli – budou sledovány, dokud symptomy neustoupí a jakákoli abnormální laboratorní hodnota se nevrátí na výchozí hodnotu, nebo dokud nebude uspokojivé vysvětlení pozorovaných změn, nebo do smrti. , v takovém případě bude poskytnuta úplná patologická zpráva od kvalifikovaného patologa. Všechna zjištění musí být hlášena na stránce „nežádoucí událost“ ve formuláři záznamu o případu.

Všechny nežádoucí příhody budou hlášeny a dokumentovány, jak je popsáno níže. Nežádoucí účinky jsou rozděleny do kategorií „závažné“ a „nezávažné“. To určuje postup, který musí být použit pro hlášení/dokumentaci nežádoucí příhody (viz níže).

6.1 Definice závažných a nezávažných nežádoucích příhod

Závažná nežádoucí příhoda je:

• Jakákoli událost, která je smrtelná nebo život ohrožující
• Jakákoli událost, která je trvale deaktivována
• Jakákoli událost, která vyžaduje nebo prodlužuje hospitalizaci
• Jakákoli událost, která zahrnuje rakovinu, vrozenou abnormalitu nebo nastane v důsledku předávkování (aplikace vyšší než stanovené dávky).

Nežádoucí účinky, které nespadají do těchto kategorií, jsou definovány jako nezávažné.

6.2 Posouzení závažnosti AE

Bez ohledu na klasifikaci nežádoucí příhody jako závažnou nebo nezávažnou (viz výše), její závažnost musí být posouzena jako mírná, střední nebo závažná pouze podle lékařských kritérií:

Mírná = nenarušuje rutinní činnosti, přijatelná Střední = zasahuje do rutinních činností Těžká = nelze provádět rutinní činnosti, je lékařem považována za nepřijatelnou, vyžaduje léčbu, vyžaduje přerušení studie nebo má reziduální účinek.

Je třeba poznamenat, že závažná nežádoucí příhoda nemusí mít závažný charakter. Bez ohledu na závažnost musí být všechny závažné nežádoucí příhody hlášeny níže.

6.3 Hlášení/dokumentace nežádoucích příhod Nežádoucí příhody se shromažďují spontánním hlášením. 6.3.1 Hlášení/dokumentace závažných nežádoucích příhod Všechny závažné nežádoucí příhody, které se vyskytnou během této studie, ať už jsou považovány za spojené se studií či nikoli, musí být zdokumentovány na stránce "Nežádoucí příhoda" ve formuláři záznamu případu.

Musí být připravena a shromážděna následná zpráva obsahující všechny nové informace získané o závažné události.

Zkoušející předloží na požádání kopie všech těchto zpráv etické komisi. V případě potřeby budou vyšetřovatelé informovat úřady.

6.3.2 Hlášení/dokumentace nezávažných nežádoucích příhod Tyto mají být zdokumentovány na stránce „Nežádoucí příhoda“ ve formuláři záznamu případu.

7 Statistická analýza Tyto analýzy se budou snažit prozkoumat jakékoli statisticky významné rozdíly v podélných trajektoriích nosních cytokinů mezi zdravými jedinci, atopickými jedinci a astmatiky. Nejprve provedeme základní deskriptivní statistiku. Charakteristika předmětu (např. zdravotní stav, demografické proměnné) a výsledné proměnné (např. nazální uvolňování cytokinů, klinické odezvy) budou popsány výpočtem maxima, minima, mediánu, průměru a standardní odchylky pro metrické proměnné a absolutní a relativní frekvence pro kategorické proměnné pro každou skupinu subjektů (zdraví jedinci, atopičtí jedinci a astmatici).

Log-změny od výchozí hodnoty budou porovnány mezi skupinami a v každém časovém bodě pomocí t-testů pro každé párové srovnání mezi skupinami, aby se prozkoumal tvar trajektorií v průběhu času. Pro grafickou ilustraci budou vyneseny individuální trajektorie změn logaritmu-základní čáry každého pacienta a také skupinové průměry s 95% CI.

Pokud log-změny-od-základní hodnoty vykazují přiměřenou linearitu, budeme testovat souvislost mezi skupinami subjektů a podélnými trajektoriemi pomocí smíšených lineárních modelů s náhodnými průsečíky specifickými pro subjekt, abychom zohlednili intraindividuální korelace opakovaných měření a seskupíme podle termíny časové interakce pro testování statisticky významných rozdílů v trajektoriích. Motivací tohoto smíšeného modelovacího přístupu bude zvýšení výkonu kombinováním informací ve více časových bodech. Budou také vyneseny průměrné trajektorie a 95% CI odvozené ze smíšené modelovací práce.

8 Etické a právní aspekty Studie bude provedena v souladu s místními právními požadavky a GCP. Bude prováděna v souladu s pokyny Helsinské deklarace (1964), včetně aktuálních revizí.

8.1 Informovaný souhlas subjektu Před přijetím do studie musí subjekt souhlasit s účastí poté, co mu byla vysvětlena povaha, rozsah a možné důsledky klinické studie formou pro něj srozumitelnou. Subjekt musí dát souhlas písemně. Podpis zkoušejícího potvrdí souhlas subjektu. Pacient může svůj souhlas odvolat, a to i bez vyjádření, kdykoli a bez negativních důsledků pro jeho budoucí lékařskou péči. Vzorky nasorpce a/nebo RNA a/nebo krve mohou být zaslány v anonymizované podobě spolupracujícím partnerům mimo Rakousko k analýze (např. analýza štěpeného a celého IL-33 od AstraZeneca, Cambridge UK). Pacient je o tom informován ve formuláři informovaného souhlasu.

8.2 Potvrzení/schválení studie Před zahájením studie bude protokol o studii předložen Etické komisi lékařské univerzity ve Vídni a všeobecné nemocnici ve Vídni (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Vídeň, Rakousko).

8.3 Pojištění Všechny subjekty účastnící se této studie budou pojištěny u pojišťovny Zürich (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vídeň, Tel. +43 50 1255 1255).

8.4 Důvěrnost Jména všech subjektů budou uchovávána v tajnosti ve spisech vyšetřovatelů. Subjekty budou identifikovány v průběhu dokumentace a hodnocení podle počtu, který jim byl přidělen během studie. Subjektům bude řečeno, že všechny výsledky studie budou uloženy a bude s nimi nakládáno v nejpřísnější důvěrnosti.

9 Dokumentace a využití výsledků studie 9.1 Dokumentace výsledků studie Všechny výsledky shromážděné během studie budou shromážděny ve zdrojovém datovém souboru a později budou převedeny do formulářů pro kazuistiku (CRF). Všechny záznamy na formulářích pro záznam případu budou provedeny čitelně černým nebo modrým inkoustem. Pokud jsou provedeny opravy záznamů ve formuláři záznamu případu, slova nebo čísla budou zakroužkována a přes ně nakreslena jedna čára. Správná hodnota bude vložena vedle starého záznamu a data a oprava bude parafována. Nesprávné údaje nesmí být zakryty korekční kapalinou nebo žádným způsobem vymazány nebo nečitelné. Vyplněné CRF podepíše zkoušející. CRF budou vyplněny ihned po závěrečné zkoušce. Zdravotní záznamy, na kterých je CRF založen, budou uchovávány po dobu nejméně 15 let.

9.2 Využití výsledků studie Výsledky této studie budou výzkumníky publikovány ve vědeckém časopise a prezentovány na vědeckých setkáních. Rukopis bude před odesláním rozeslán všem spoluřešitelům.

10 Úvahy o potenciálních rizicích a přínosech pro účastníky studie a výběr dávky

Zahrnutí účastníci nebudou mít ze studie přímý prospěch. Protože však kinetika mechanické stimulace sliznic stále není zcela pochopena, tato komplexní pilotní studie poskytne příležitost vést budoucí výzkum, který snad povede k objevu nových terapeutických cílů.

Mezi potenciální rizika pro účastníky patří bolest, infekce a hematom v místě odběru krve. Při odběru vzorků nosní sliznice a sekretu je možným rizikem lehké krvácení z nosu. Během SPT, ačkoli vysoce nepravděpodobné, jsou možné anafylaktické reakce. Aby se minimalizovalo riziko anafylaktických reakcí a aby byla zajištěna optimální léčba v případě výskytu anafylaktické reakce, budou pacienti po SPT sledováni minimálně 30 minut. Při všech návštěvách účastníků bude po celou dobu k dispozici vyškolený personál a pohotovostní léky.