Kinetik för nasala cytokinsvar på mekanisk stimulering

Allergisk rinit (AR) och allergisk astma är vanliga manifestationer av typ I-allergi, en IgE-medierad överkänslighetssjukdom som uppskattas påverka så mycket som 40 % av världens befolkning. IgE produceras av B-celler och binder till ytan av mastceller och basofiler via sin högaffinitets-Fce-receptor I (FceRI). Tvärbindning av yt-IgE av dess specifika allergen inducerar degranulering av cellerna såväl som frisättning av inflammatoriska mediatorer. Denna process som utvecklas under några minuter leder till de typiska ögon-, näs- och lungsymtomen på AR och astma, såsom klåda, ögonrodnad, rinnande och/eller tilltäppt näsa och väsande andning på grund av luftinstängning som ett resultat av obstruktion i nedre luftvägar. Vissa patienter kan också utveckla senfasreaktioner (LPR). Dessa reaktioner utvecklas vanligtvis 2-6 timmar efter allergenexponering, toppar i intensitet mellan 6-9 timmar och kännetecknas oftast av vävnadsödem som visar sig som luftflödeshinder i luftvägarna.

Sedan introduktionen av lättanvända och mycket absorberande anordningar för provtagning av slemhinnevätskor har mediatorerna involverade i de omedelbara och sena fasen av allergiska reaktioner och kinetiken för deras frisättning blivit väl karakteriserade under de senaste åren. Ansträngningar från Imperial College London och opublicerade data från forskargruppen i Wien har visat att nyckelmediatorer involverade i den omedelbara fasen inkluderar mastcellshärledda mediatorer, (Tryptase, PGD2), epitelalarminer (IL-33, sST2) och komplement (C3a) C4a, C5a, D-Dimer). Mediatorer involverade i reaktioner i sen fas inkluderar också alarminer (sST2, TSLP), Th2-cytokiner (IL-4, IL-5, IL-13), neutrofilmediatorer (MMP-9) och eosinofilmediatorer (EDN).

Men vad som också nyligen har blivit tydligt genom placebokontrollerade studier är att vissa mediatorer är mekaniskt medierade (opublicerade observationer), och släpps ut i den extracellulära miljön som ett resultat av själva provtagningsprocessen. Detta är av stort intresse eftersom förståelse för vilka cytokiner som är mekaniska och vilka som är allergenspecifika kommer att hjälpa till att vägleda framtida studier som försöker rikta in sig på specifika biomarkörer för behandling eller sjukdomsövervakning. För att förstå om den mekaniska frisättningen spelar någon roll i det patologiska svaret på allergener kommer olika patientkohorter att behöva undersökas för att se om deras svar skiljer sig åt på något sätt.

Studiens rationella

Mot bakgrund av detta föreslår utredarna en studie för att undersöka effekterna av slemhinneprovtagning på cytokinfrisättning från näsepitel. Utredarna planerar att prova olika patientkohorter (allergisk rinit, allergisk astma, icke-allergisk) för att se hur mekaniska effekter påverkas av provtagning och allergisk eller icke-allergisk status. Genom att inkludera 10 patienter i varje grupp hoppas utredarna kunna fastställa en rad "normala" för mekanisk frisättning av allergenrelevanta cytokiner i varje studiegrupp, vilket kommer att hjälpa till att informera framtida studier som undersöker allergenspecifika svar. För att kartlägga både de symtomatiska och objektiva svaren på luftvägsprovtagning kommer symtompoäng och luftvägsflödesmätare att användas. För att kartlägga responsens kinetik kommer deltagarna att genomgå en slemhinneprovtagningstidskurs under loppet av en 8-timmarsperiod på en enda dag. Eftersom inga interventionssubstanser ges kommer denna studie att medföra mycket låg risk för de inblandade individerna samtidigt som den kastar ett viktigt ljus över epitelsvaren på mekanisk manipulation.

Studiedesign I denna pilotstudie med ett enda center kommer totalt 36 patienter (n=12 per grupp) att rekryteras på frivillig basis och alla kommer att få näsprov. Studiedeltagare kommer att genomgå näsprov vid ett enda besök.

Visningsbesök

Procedur:

• Undertecknande av formuläret för informerat samtycke
• Tilldelning av screeningnummer
• Demografisk data
• Historia av allergi
• Bedömning av in- och uteslutningskriterier
• Graviditetstest för kvinnor vid behov av SPT
• Medicinsk historia
• Patienter som rapporterar astma i anamnesen måste tillhandahålla objektiva bevis på luftvägsobstruktion och reversibilitet (spirometrireversibilitet eller PC20 metakolin/histamin <8 mg)
• Samtidig medicinering
• Främre rhinoskopi
• Standard SPT med kommersiellt extrakt från: hassel, ask, gräsmix, ragweed, byngröt, D. pteronyssinus, D. farina, katt- och hundmjäll, alternaria, cladosporium, histamin och negativ kontroll
• Blodprovtagning (max 60 ml hepariniserat blod och serum) - En del av blodprovet kommer att skickas direkt till laboratoriet för analys av totalt IgE och specifikt IgE för relevanta allergener. Från resten av blodet kommer RNA att beredas och förvaras vid -80°C och serum kommer att separeras och förvaras vid -20°C.
• nasal provtagning (slemhinnekyrettprovtagning och nasal sekretprovtagning)

Provtagningsbesök

Procedur:

• Omvärdering av in- och uteslutningskriterier (allergenspecifika IgE-resultat)
• Registrering av samtidig medicinering
• Baslinje blodprovstagning
• Baslinjeprovtagning från näsan för båda näsborrarna (provtagning av nässekret) vid 0 min
• Baslinje TNSS-poäng
• Baslinje PNIF
• Registrering av biverkningar (AE).

• Blod, PNIF, näsprovtagning (båda näsborrarna: slemhinnekyrettprov och nässekretprov), och TNSS-poäng, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min, 400 min, 400 min, 40 min av provtagningens tidsförlopp

  4 Studieprocedurer

4.1 Deltagarnas medicinska historia, demografiska data, samtidig medicinering Deltagarna kommer att tillfrågas om sin medicinska historia inklusive demografiska data och samtidig medicinering, deras allergiska symtom inklusive intensitet och varaktighet och deras allergiska medicinhistoria.

4.2 Historik med allergi och TNSS-poäng Deltagarna kommer att bli tillfrågade om förekomst av nysningar, rinorré, nasal klåda, nästäppa och att gradera varje symptom. De kommer att använda följande symtompoängmetod: 0 = frånvarande; 1 = mild - närvarande men lätt tolererad; 2 = måttlig - närvarande, symtom är besvärande men stör inte dagliga aktiviteter; 3 = allvarligt - symptom är svårt att tolerera och stör dagliga aktiviteter.

4.3 Anterior rhinoskopi Anterior rhinoskopi kommer att utföras en gång under screeningbesöket för att utesluta anatomiska variationer (t.ex. septumavvikelse) eller patologiska förändringar (t.ex. näspolyper). Det kommer att utföras med hjälp av ett spekulum med patienten sittande med huvudet något bakåt.

4.4 Peak Inspiratory Nasal Flow Meter (PNIF) Portabiliteten och enkelheten hos PNIF ger en unik möjlighet att få objektiva mätningar. Det har också nyligen validerats som ett studieverktyg under näsallergenutmaning.

4.4.1 Procedur: PNIF använder ett rör med variabel diameter kalibrerat direkt i liter per minut tillsammans med en indikatorring med låg tröghet. Ringens position efter en inandningsmanöver indikerar det maximala flödet som uppnåtts. Enheten fungerar när en patient andas in genom munnen eller näsan, detta gör att luft dras genom mätaren och en markör rör sig längs skalan för att indikera inandningshastigheten. Den uppnådda flödeshastigheten kan noteras genom att kontrollera markörens position mot den kalibrerade skalan.

4.4.2 PNIF i studieuppförande: Deltagarna kommer att utbildas i hur man använder PNIF på studiedagen och sedan kommer det att användas vid alla studietillfällen för att få information om näsflöde.

4.5 Hudstickstest 4.5.1 Procedur: Allergener förs in i underarmens dermis genom att försiktigt sticka huden genom en droppe (20 ul) av en allergenhaltig lösning med en steril lansett med minst 2 cm mellan varje enskild appliceringspunkt. 0,9 % natriumkloridlösning kommer att användas som negativ och histamin som positiv kontroll. Hos tidigare sensibiliserade individer kommer kliande svullnad och en rodnad av huden (hår och flare reaktion) att inträffa inom 15 minuter efter provokation med respektive allergen. Efter 20 minuter kommer allergenlösningar att torkas av och marginalerna på vallarna kommer att spåras med en kulspetspenna. Genomskinlig tejp kommer att fästas på huden för att överföra konturerna av valsen till tejpen för skivorna. Ytan på valen kommer att beräknas med digital planimetri. För inkludering kommer valar med en diameter på minst 3 mm att betraktas som positiva reaktioner.

4.5.2 Testlösningar: En kommersiellt tillgänglig panel av träd- och gräspollen, ogräs och perenna allergener (Allergopharma, Wien, Österrike) kommer att användas vid screeningbesöket och kommer att förvaras enligt tillverkarens instruktioner. Som kontroller kommer steril 0,9 % NaCl-lösning (negativ kontroll) och histamin (positiv kontroll, Allergopharma, Wien, Österrike) att användas. De kommer att förvaras enligt tillverkarens instruktioner.

4.5.3 SPT i studieuppförande:

Visningsbesök:

Ett standardprov på huden med kommersiellt björkpollenextrakt och en panel av träd- och gräspollen, ogräs och perenna allergener (alla Allergopharma, Wien, Österrike) som används vid rutindiagnostik på ÖNH-avdelningens allergiklinik kommer att utföras för att bedöma deltagarnas sensibiliseringsprofil vid screeningbesöket.

4.5.4 Säkerhetsåtgärder Som en säkerhetsåtgärd kommer deltagarna att övervakas i 30 minuter efter testning. Alla utredningar kommer att göras i ÖNH-mottagningens poliklinik där full akututrustning finns tillgänglig.

4.6 Blodprovtagning och mätning av immunologiska parametrar Blodprov kommer att tas vid screeningbesöket och vid alla studiebesök genom punktering av antecubitalvenen före hudtestning. Maximalt 60 ml per besök kommer att tas antingen hepariniserat (t.ex. för basofila känslighetsanalyser) eller för beredning av serum (t.ex. för bedömning av totala och allergenspecifika immunglobulinnivåer eller RBL-analys). Serumflaskor kommer att behandlas och serum kommer att förvaras vid -20°C. Allergenspecifik IgE i blodprover från screeningbesöket kommer att mätas av CAP-FEIA för att bedöma den allergenspecifika RAST-klassen hos patienterna. Mätning av totalt, fritt och allergenspecifikt serum IgE, IgG, IgA och IgM kommer att utföras antingen med CAP-FEIA, genom mikroarraymätning eller ELISA. Immunförmedlare kommer att mätas med hjälp av MSD-plattformen antingen av oss eller av våra samarbetspartners på AstraZeneca, Cambridge, Storbritannien. Mätningen kommer att utföras i slutet av studien i alla insamlade serumprover för att minimera variationen mellan analysen.

4.7 Graviditetstest Hos kvinnliga deltagare kommer graviditet att uteslutas med ett vanligt uringraviditetstest. Testet kommer att utföras före det första hudpricktestet vid screeningbesöket och efteråt en gång i månaden.

4.8 Nasal provtagning Nasal provtagning kommer att utföras vid alla besök. För varje besök kommer prover att samlas in med hjälp av nasosorption FXi/PU (innehållande en syntetisk absorptiv matris (SAM)), eller en 10 cm lång plastkyrett (nasosorptionsanordningar från Hunt Developments, Storbritannien) (Curetteanordningar från Arlington Scientific, USA)

4.8.1 Nasosorption med FXi/PU (Hunt Developments, Storbritannien). Under visualisering kommer enheten att föras in i näshålan och placeras längs sidoväggen mot den nedre turbinatet. Patientens pekfinger kommer att användas för att trycka på de yttre aspekterna av larmet och sidonäsbrosket för att hålla enheten på plats. Efter 1 minut kommer enheterna att tas bort och sedan frysas vid -80°C.

4.8.2 Slemhinne-mRNA-provtagning En 10 cm näskyrett (antingen Rhino-Probe, Arlington Scientific, USA eller Cellskim, Hunt Developments, Storbritannien) kommer att användas. Under direkt visualisering kommer kyretten att bringas att ligga mot den mittre delen av den nedre turbinaten. Kyretten kommer att pressas mot slemhinneytan flyttas utåt 2-3 gånger. Denna rörelse kommer att upprepas 2-3 gånger för att säkerställa en bra provtagning. Denna kyrett och teknik har visat sig inte orsaka något betydande obehag för deltagarna och därför har den fördelen att det inte krävs någon lokalbedövning. Efter insamling kommer cellerna att lyseras i Qiagen RLT-buffert och förvaras vid -80°C för senare mRNA-analys.

5 Undersökningsprodukter och studiemedicinering 5.3 Samtidig medicinering 5.3.1 Allmänt All ytterligare medicinering som tas av försökspersonerna vid inträde i studien eller när som helst under studien betraktas som samtidig medicinering och kommer att dokumenteras i CRF. Samtidig medicinering bör hållas till ett minimum under studien, men om det anses nödvändigt kan det ges om det inte stör studieprotokollet.

5.3.2 Räddningsmedicin Även om anafylaktiska händelser är mycket osannolika i denna studie måste de alltid anses möjliga. Därför kommer ett komplett akutpaket att finnas tillgängligt omedelbart vid anafylaktiska reaktioner vid SPT. Dessutom om deltagaren lider av starka hudsymptom efter SPT kommer desloratadin 5 mg att tillhandahållas för att lindra symptomen.

5.3.3 Förbjuden samtidig medicinering

Försökspersonerna måste förbli utan mediciner som stör studieprocedurerna under hela studien. Följande samtidiga behandlingar är inte tillåtna under denna studie:

• Systemiska eller topikala kortikosteroider
• Andra immunsuppressiva läkemedel
• Antihistaminer eller dinatriumkromoglykat 3 dagar före screeningbesöket
• Systemiska eller intranasala adrenerga läkemedel
• Psykofarmakologiska läkemedel

• ACE-hämmare eller betablockerare

  6 Biverkningar En biverkning är varje händelse under en klinisk studie, inklusive interkurrent sjukdom eller olycka, som försämrar patientens välbefinnande; det kan också ta formen av ett onormalt laboratorievärde. Termen biverkning innebär inte ett orsakssamband med studiebehandlingen.

Alla försökspersoner som upplever biverkningar - oavsett om de anses associerade med användningen av studiebehandlingen eller inte - kommer att övervakas tills symtomen avtar och eventuella onormala laboratorievärden har återgått till baslinjen, eller tills det finns en tillfredsställande förklaring för de observerade förändringarna, eller tills döden , i vilket fall en fullständig patologirapport från en kvalificerad patolog kommer att tillhandahållas. Alla fynd ska rapporteras på en "biverkningssida" i ärendeprotokollet.

Alla biverkningar kommer att rapporteras och dokumenteras enligt beskrivningen nedan. Biverkningar delas in i kategorierna "allvarliga" och "icke allvarliga". Detta bestämmer vilket förfarande som måste användas för att rapportera/dokumentera biverkningen (se nedan).

6.1 Definition av allvarliga och icke-allvarliga biverkningar

En allvarlig biverkning är:

• Varje händelse som är dödlig eller livshotande
• Alla händelser som permanent inaktiveras
• Varje händelse som kräver eller förlänger sjukhusvistelse
• Varje händelse som involverar cancer, medfödd abnormitet eller uppstår som ett resultat av överdosering (tillämpning av mer än den föreskrivna dosen).

Biverkningar som inte faller inom dessa kategorier definieras som icke allvarliga.

6.2 Bedömning av svårighetsgraden av AE

Oavsett klassificeringen av en biverkning som allvarlig eller icke-allvarlig (se ovan), måste dess svårighetsgrad bedömas som mild, måttlig eller svår, enbart enligt medicinska kriterier:

Mild = stör inte rutinaktiviteter, acceptabelt Måttlig = stör rutinaktiviteter Allvarlig = omöjlig att utföra rutinaktiviteter, anses vara oacceptabel av läkaren, kräver behandling, kräver avbrytande av studien eller har kvarvarande effekt.

Det bör noteras att en allvarlig biverkning inte behöver vara allvarlig till sin natur. Oavsett svårighetsgrad måste alla allvarliga biverkningar rapporteras enligt nedan.

6.3 Rapportering/dokumentation av biverkningar Biverkningar samlas in genom spontanrapportering. 6.3.1 Rapportering/dokumentation av allvarliga biverkningar Alla allvarliga biverkningar som inträffar under denna studie, oavsett om de anses vara förknippade med studien eller inte, ska dokumenteras på en "Biverkning"-sida i journalformuläret.

En uppföljningsrapport inklusive all ny information som erhållits om den allvarliga händelsen ska upprättas och kommer att samlas in.

Utredaren kommer på begäran att lämna in kopior av alla dessa rapporter till den etiska kommittén. Vid behov kommer utredarna att informera myndigheterna.

6.3.2 Rapportering/dokumentation av icke allvarliga biverkningar Dessa ska dokumenteras på en sida "Biverkning" i ärendejournalen.

7 Statistisk analys Dessa analyser kommer att försöka utforska eventuella statistiskt signifikanta skillnader i longitudinella nasala cytokinbanor mellan friska individer, atopiska individer och astmatiker. Vi kommer först att genomföra grundläggande beskrivande statistik. Ämnesegenskaper (t.ex. hälsostatus, demografiska variabler) och utfallsvariabler (t.ex. nasal cytokinfrisättning, kliniska svar) kommer att beskrivas genom att beräkna maximi-, minimum-, median-, medel- och standardavvikelse för metriska variabler och absoluta och relativa frekvenser för kategoriska variabler för varje ämnesgrupp (friska individer, atopiska individer och astmatiker).

Loggförändringar från baslinjen kommer att jämföras mellan grupper, och vid varje tidpunkt med hjälp av t-tester för varje parvis jämförelse mellan grupper, för att utforska formen av banor-över tid. För grafisk illustration kommer de individuella log-baslinje-ändringsbanorna för varje patient att plottas såväl som gruppmedelvärden med 95 % CI.

Om log-förändringar-från-baslinje-uppvisar rimlig linjäritet, kommer vi att testa för ett samband mellan ämnesgrupper och longitudinella banor med hjälp av blandade linjära modeller med ämnesspecifika slumpmässiga intercepts för att ta hänsyn till intraindividuella korrelationer av upprepade mätningar, och gruppera efter tidsinteraktionstermer för att testa för statistiskt signifikanta skillnader i banor. Motivationen för denna blandade modelleringsmetod kommer att vara att öka kraften genom att kombinera information över flera tidpunkter. Genomsnittliga banor och 95 % CI som härleds av det blandade modelleringsarbetet kommer också att plottas

8 Etiska och juridiska aspekter Studien kommer att genomföras i enlighet med lokala lagkrav och GCP. Den kommer att utföras i enlighet med riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen (1964), inklusive aktuella revisioner.

8.1 Informerat samtycke från försöksperson Innan försökspersonen antas till studien måste försökspersonen ha samtyckt till att delta efter att den kliniska studiens art, omfattning och eventuella konsekvenser har förklarats i en för honom/henne begriplig form. Försökspersonen måste ge skriftligt samtycke. Utredarens underskrift bekräftar försökspersonens samtycke. Patienten kan när som helst och utan negativa konsekvenser för hans framtida sjukvård återkalla samtycket, även utan att lämna synpunkter. Nasosorption och/eller RNA- och/eller blodprover kan skickas i anonymiserad form till samarbetspartners utanför Österrike för analys (t. analys av klyvd och hel IL-33 av AstraZeneca, Cambridge UK). Patienten informeras om detta i blanketten för informerat samtycke.

8.2 Bekräftelse/godkännande av studien Innan studien påbörjas kommer studieprotokollet att överlämnas till den etiska kommittén vid det medicinska universitetet i Wien och det allmänna sjukhuset i Wien (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Wien, Österrike).

8.3 Försäkring Alla försökspersoner som deltar i denna studie kommer att vara försäkrade hos Zürichs försäkringsbolag (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Wien, tel. +43 50 1255 1255).

8.4 Sekretess Alla försökspersoners namn kommer att hållas hemliga i utredarnas akter. Försökspersoner kommer att identifieras genom hela dokumentationen och utvärderingen av det antal som tilldelats dem under studien. Försökspersonerna kommer att få veta att alla studieresultat kommer att lagras och hanteras strikt konfidentiellt.

9 Dokumentation och användning av studieresultat 9.1 Dokumentation av studieresultat Alla resultat som samlas in under studien kommer att samlas i en källdatafil och kommer senare att överföras till fallrapportformulären (CRF). Alla anteckningar på ärendeformuläret kommer att göras läsligt med svart eller blått bläck. Om korrigeringar görs i anteckningar i ärendeprotokollet kommer orden eller siffrorna att ringmärkas och ett enda streck dras igenom dem. Rätt värde kommer att anges bredvid den gamla inmatningen och datumet och korrigeringen kommer att initialiseras. Felaktiga inmatningar får inte täckas med korrigeringsvätska eller raderas eller göras oläsliga på något sätt. De ifyllda CRF:erna kommer att undertecknas av utredaren. CRF kommer att slutföras omedelbart efter slutprovet. De journaler som ligger till grund för CRF kommer att bevaras i minst 15 år.

9.2 Användning av studieresultaten Resultaten av denna studie kommer att publiceras av utredarna i en vetenskaplig tidskrift och presenteras vid vetenskapliga möten. Manuskriptet kommer att cirkuleras till alla medutredare innan det skickas in.

10 överväganden om potentiella risker och fördelar för studiedeltagare och val av dos

De inkluderade deltagarna kommer inte att dra direkt nytta av studien. Men eftersom kinetiken för mekanisk slemhinnestimulering fortfarande inte är helt förstådd kommer denna omfattande pilotstudie att ge en möjlighet att vägleda framtida forskning som förhoppningsvis kommer att leda till upptäckten av nya terapeutiska mål.

Potentiella risker för deltagarna inkluderar smärta, infektion och hematom på platsen för blodtagning. Vid nässlemhinna och sekretprovtagning är lätt näsblödning en möjlig risk. Under SPT, även om det är mycket osannolikt, är anafylaktiska reaktioner en möjlighet. För att minimera risken för anafylaktiska reaktioner och för att ge optimal behandling om en anafylaktisk reaktion skulle inträffa, kommer patienter att övervakas i minst 30 minuter efter SPT. Vid alla deltagarbesök kommer utbildad personal och akutmedicin att finnas tillgänglig hela tiden.