機械的刺激に対する鼻サイトカイン応答の動態

アレルギー性鼻炎 (AR) およびアレルギー性喘息は、I 型アレルギーの一般的な症状であり、世界人口の 40% が罹患していると推定される IgE 媒介過敏症です。 IgE は B 細胞によって産生され、その高親和性 Fce 受容体 I (FceRI) を介してマスト細胞および好塩基球の表面に結合します。 特定のアレルゲンによる表面 IgE の架橋は、細胞の脱顆粒と炎症性メディエーターの放出を誘発します。 数分かけて進行するこのプロセスは、かゆみ、目の赤み、鼻水や鼻詰まり、下気道閉塞による空気の滞留による喘鳴などの、AR および喘息の典型的な眼、鼻、肺の症状を引き起こします。 患者によっては、後期反応（LPR）を発症する場合もあります。 これらの反応は通常、アレルゲン曝露後 2 ～ 6 時間で発生し、強度は 6 ～ 9 時間でピークに達し、主に気道の気流閉塞として現れる組織浮腫を特徴とします。

使いやすく吸収性の高い粘膜液サンプリング装置の導入以来、即時期および後期のアレルギー反応に関与するメディエーターとその放出の動態は、ここ数年でよく特徴付けられるようになりました。 インペリアル・カレッジ・ロンドンの取り組みとウィーンの研究者グループの未発表データにより、即時相に関与する主要なメディエーターには、マスト細胞由来メディエーター（トリプターゼ、PGD2）、上皮アラーミン（IL-33、sST2）、補体（C3a）が含まれることが示されています。 、C4a、C5a、D-ダイマー）。 後期反応に関与するメディエーターには、アラーミン (sST2、TSLP)、Th2 サイトカイン (IL-4、IL-5、IL-13)、好中球メディエーター (MMP-9)、および好酸球メディエーター (EDN) も含まれます。

しかし、プラセボ対照研究を通じて最近明らかになったのは、一部のメディエーターは機械的に媒介され（未発表の観察）、サンプリングプロセス自体の結果として細胞外環境に放出されるということです。 どのサイトカインが機械的で、どのサイトカインがアレルゲン特異的であるかを理解することは、治療や疾患のモニタリングのために特定のバイオマーカーをターゲットにしようとする将来の研究の指針となるため、これは極めて興味深い。 機械的放出がアレルゲンに対する病理学的反応において何らかの役割を果たしているかどうかを理解するには、さまざまな患者コホートを調査して、その反応が何らかの点で異なるかどうかを確認する必要があります。

研究の根拠

これを考慮して、研究者らは、鼻上皮からのサイトカイン放出に対する粘膜サンプリングの影響を調査する研究を提案している。 研究者らは、さまざまな患者コホート（アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、非アレルギー性）をサンプリングして、サンプリングとアレルギー性または非アレルギー性の状態が機械的影響にどのような影響を与えるかを確認する予定です。 研究者らは、各グループに10人の患者を含めることで、各研究グループにおけるアレルゲン関連サイトカインの機械的放出の「正常」範囲を確立し、アレルゲン特異的反応を調査する将来の研究に情報を提供したいと考えている。 気道サンプリングに対する症候性反応と客観的反応の両方をマッピングするために、症状スコアと気道流量計が使用されます。 反応の動態をマッピングするために、参加者は 1 日 8 時間にわたる粘膜サンプリングのタイムコースを受けます。 介入物質が投与されていないため、この研究は関係者に対するリスクが非常に低いと同時に、機械的操作に対する上皮の反応に重要な光を当てることになります。

研究デザイン この単一センターでのパイロット研究では、合計 36 人の患者 (各グループ n=12) が自発的に募集され、全員が鼻腔サンプリングを受けます。 研究参加者は 1 回の来院で鼻のサンプリングを受けます。

スクリーニング訪問

手順：

• インフォームド・コンセントフォームへの署名
• 上映番号の割り当て
• 人口統計データ
• アレルギー歴
• 包含基準と除外基準の評価
• SPTが必要な場合の女性の妊娠検査
• 病歴
• 喘息の病歴を報告する患者は、気道閉塞と可逆性（スパイロメトリーの可逆性または PC20 メタコリン/ヒスタミン <8mg）の客観的証拠を提供する必要があります。
• 併用薬
• 前部鼻鏡検査
• 標準 SPT に含まれる市販の抽出物: ハシバミ、トネリコ、草ミックス、ブタクサ、ヨモギ、D. pteronyssinus、D. farina、猫と犬のフケ、オルタナリア、クラドスポリウム、ヒスタミンおよびネガティブ コントロール
• 血液サンプリング (最大 60 ml のヘパリン添加血液および血清) - 血液サンプルの一部は、総 IgE および関連するアレルゲンに対する特異的 IgE の分析のために検査室に直接送られます。 残りの血液から RNA を調製して -80°C で保存し、血清を分離して -20°C で保存します。
• 鼻採取（粘膜キュレット採取および鼻汁採取）

サンプリング訪問

手順：

• 許容基準および除外基準の再評価 (アレルゲン特異的 IgE の結果)
• 併用薬の記録
• ベースライン採血
• 0分での両鼻孔のベースライン鼻検体採取（鼻汁サンプリング）
• ベースライン TNSS スコア
• ベースライン PNIF
• 有害事象（AE）の記録

• 血液、PNIF、鼻採取（両鼻孔：粘膜キュレット採取および鼻汁採取）、TNSSスコア、発症後15分、30分、45分、60分、75分、90分、120分、180分、240分、300分、360分、420分、480分サンプリングのタイムコース

  4 研究手順

4.1 参加者の病歴、人口統計データ、併用薬 参加者には、人口統計データと併用薬を含む病歴、強度と期間を含むアレルギー症状、およびアレルギー薬の服用歴が尋ねられます。

4.2 アレルギーの病歴と TNSS スコア 参加者は、くしゃみ、鼻漏、鼻そう痒症、鼻づまりの有無を尋ねられ、各症状を等級付けします。 彼らは次の症状スコア法を使用します: 0 = 存在しない。 1 = 軽度 - 存在するが容易に許容されます。 2 = 中等度 - 症状はありますが、日常生活活動には支障はありません。 3 = 重度 - 症状に耐えることが難しく、日常生活活動に支障をきたしています。

4.3 前部鼻鏡検査 前部鼻鏡検査は、解剖学的差異（例: 中隔偏位）または病理学的変化（例、 鼻ポリープ）。 患者が頭を少し後ろに向けて座った状態で検鏡を使用して行われます。

4.4 ピーク吸気鼻流量計 (PNIF) PNIF の携帯性と容易さは、客観的な測定値を取得するユニークな機会を提供します。 最近では、鼻アレルゲン攻撃中の研究ツールとしても検証されました。

4.4.1 手順: PNIF は、低慣性表示リングとともに、毎分リットル単位で直接校正された可変直径チューブを使用します。 吸気操作後のリングの位置は、達成された最大流量を示します。 この装置は患者が口または鼻から吸入すると作動し、これにより空気がメーターを通って引き込まれ、カーソルがスケールに沿って移動して吸入速度を示します。 達成された流量は、校正されたスケールに対してカーソルの位置を確認することで確認できます。

4.4.2 研究実施における PNIF: 参加者は研究当日に PNIF の使用方法を訓練され、その後、鼻の流れに関する情報を得るためにすべての研究時点で PNIF が使用されます。

4.5 皮膚プリックテスト 4.5.1 手順: アレルゲンは、個々の適用点の間を少なくとも 2 cm 離して滅菌ランセットでアレルゲン含有溶液の 1 滴 (20 μl) を通して皮膚を静かに刺すことによって、前腕の真皮に挿入されます。 ０．９％塩化ナトリウム溶液を陰性対照として使用し、ヒスタミンを陽性対照として使用する。 以前に感作された人では、それぞれのアレルゲンによる攻撃により 15 分以内にかゆみを伴う腫れと皮膚の発赤 (膨疹および発赤反応) が起こります。 20分後、アレルゲン溶液を拭き取り、膨疹の縁をボールペンでなぞります。 皮疹の輪郭を記録用テープに転写するため、透明テープを皮膚に貼り付けます。 膨疹の表面はデジタル面積測定によって計算されます。 含めるために、少なくとも直径 3 mm の膨疹は陽性反応とみなされます。

4.5.2 試験溶液：樹木および草の花粉、雑草および多年生アレルゲンの市販のパネル（Allergopharma、ウィーン、オーストリア）をスクリーニング訪問時に使用し、製造業者の指示に従って保管する。 対照として、滅菌0.9% NaCl溶液(陰性対照)およびヒスタミン(陽性対照、Allergopharma、ウィーン、オーストリア)を使用する。 メーカーの指示に従って保管されます。

4.5.3 研究実施における SPT:

スクリーニング訪問:

市販のシラカバ花粉抽出物と、樹木および草の花粉、雑草および多年生アレルゲン（すべて Allergopharma、ウィーン、オーストリア）のパネルを使用した標準的な皮膚プリックテストが、耳鼻咽喉科のアレルギークリニックでの日常的な診断に使用されているように実行され、症状を評価します。スクリーニング訪問時の参加者の感作プロファイル。

4.5.4 安全上の予防措置 安全上の予防措置として、参加者はテスト後 30 分間監視されます。 すべての検査は、緊急設備が完備された耳鼻咽喉科の外来クリニックで行われます。

4.6 血液サンプルと免疫学的パラメータの測定 スクリーニング訪問時およびすべての研究訪問時、皮膚検査の前に前肘静脈の穿刺によって血液サンプルを採取します。 ヘパリン処理（好塩基球感受性アッセイなど）または血清の調製（総免疫グロブリンレベルおよびアレルゲン特異的免疫グロブリンレベルの評価またはRBLアッセイなど）のために、1回の来院あたり最大60mlが採取されます。 血清バイアルは処理され、血清は -20°C で保存されます。 スクリーニング訪問の血液サンプルのアレルゲン特異的 IgE は、患者のアレルゲン特異的 RAST クラスを評価するために CAP-FEIA によって測定されます。 総血清、遊離血清、およびアレルゲン特異的血清 IgE、IgG、IgA、および IgM の測定は、CAP-FEIA、マイクロアレイ測定、または ELISA のいずれかによって実行されます。 免疫メディエーターは、当社または英国ケンブリッジにあるアストラゼネカの協力者によって MSD プラットフォームを使用して測定されます。 測定は、アッセイ間の変動を最小限に抑えるために、収集されたすべての血清サンプルについて研究の最後に実行されます。

4.7 妊娠検査 女性参加者の場合、標準的な尿妊娠検査で妊娠は除外されます。 この検査は、スクリーニング訪問時の最初の皮膚プリックテストの前と、その後は月に1回行われます。

4.8 鼻腔標本採取 鼻腔標本採取はすべての来院時に行われます。 来院ごとに検体は、経鼻吸収FXi/PU（合成吸収マトリックス（SAM）を含む）、または長さ10cmのプラスチック製キュレット（英国Hunt Developments社の経鼻吸収装置）（米国Arlington Scientific社のキュレット装置）を使用して収集されます。

4.8.1 FXi/PU (Hunt Developments、英国) を使用した経鼻吸収。 視覚化しながら、デバイスを鼻腔に挿入し、下鼻甲介の側壁に沿って配置します。 患者の人差し指を使用して鼻翼および側鼻軟骨の外側を押し、デバイスを所定の位置に保持します。 1 分後、デバイスは取り外され、-80°C で凍結されます。

4.8.2 粘膜 mRNA サンプリング 10cm の鼻キュレット (Rhino-Probe、Arlington Scientific、米国、または Cellskim、Hunt Developments、英国) を使用します。 直接視覚化しながら、キュレットを下鼻甲介の中央下部分に当てます。 キュレットを粘膜表面に押し当て、外側に2〜3回動かします。 この動作を 2 ～ 3 回繰り返して、サンプルを確実に収集します。 このキュレットと技術は参加者に重大な不快感を引き起こさないことが証明されており、したがって局所麻酔を必要としないという利点があります。 収集後、細胞は Qiagen RLT バッファーで溶解され、後の mRNA 分析のために -80°C で保存されます。

5 治験製品および治験薬 5.3 併用投薬 5.3.1 一般 研究への参加時または試験中の任意の時点で被験者が服用しているすべての追加投薬は併用投薬とみなされ、CRF に記録されます。 併用薬は研究中最小限に抑える必要がありますが、研究プロトコールを妨げない限り、必要とみなされる場合には投与することができます。

5.3.2 レスキュー投薬 この研究ではアナフィラキシー事象の可能性は非常に低いですが、常に可能性があると考えておく必要があります。 したがって、SPT でアナフィラキシー反応が発生した場合には、完全な緊急キットがすぐに利用可能になります。さらに、参加者がSPT後に強い皮膚症状に苦しんでいる場合は、症状を改善するためにデスロラタジン5mgが提供されます。

5.3.3 併用禁止薬

被験者は、研究期間中、研究手順を妨げる薬剤を服用し続けなければなりません。 この研究では、以下の併用治療は許可されません。

• 全身または局所コルチコステロイド
• その他の免疫抑制薬
• スクリーニング訪問の3日前に抗ヒスタミン薬またはクロモグリク酸二ナトリウムを投与
• 全身または鼻腔内アドレナリン作動薬
• 精神薬理薬

• ACE阻害剤またはβ遮断薬

  6 有害事象 有害事象とは、併発する病気や事故など、被験者の健康を損なう臨床研究中のあらゆる事象を指します。また、異常な検査値の形をとることもあります。 有害事象という用語は、研究治療との因果関係を意味するものではありません。

有害事象を経験したすべての被験者は、治験治療の使用に関連していると考えられるかどうかにかかわらず、症状が治まり、異常な検査値がベースラインに戻るまで、または観察された変化について満足のいく説明が得られるまで、または死亡するまで監視されます。その場合、資格のある病理学者からの完全な病理レポートが提供されます。 すべての所見は、症例記録フォームの「有害事象」ページで報告されなければなりません。

すべての有害事象は、以下に説明するように報告され文書化されます。 有害事象は「重篤」と「非重篤」に分類されます。 これにより、有害事象を報告/文書化するために使用しなければならない手順が決まります (下記を参照)。

6.1 重篤な有害事象と非重篤な有害事象の定義

重篤な有害事象は次のとおりです。

• 致命的または生命を脅かすあらゆる出来事
• 永久に無効にするイベント
• 入院が必要な、または入院が長引くあらゆる出来事
• がん、先天異常を伴うイベント、または過剰摂取（規定量を超える投与）の結果として発生するイベント。

これらのカテゴリーに当てはまらない有害事象は、非重篤なものとして定義されます。

6.2 AE の重症度の評価

有害事象の重篤または非重篤の分類に関係なく (上記を参照)、その重篤度は、医学的基準のみに従って、軽度、中等度、または重度として評価されなければなりません。

軽度 = 日常生活に支障をきたさない、許容範囲 中等度 = 日常生活に支障がある 重度 = 日常生活を行うことが不可能、医師が容認できないとみなした、治療が必要、研究の中止が必要、または残留影響がある。

重篤な有害事象は本質的に重篤である必要はないことに留意すべきである。 重症度に関係なく、すべての重篤な有害事象は以下のように報告する必要があります。

6.3 有害事象の報告/文書化 有害事象は自発的な報告によって収集されます。 6.3.1 重篤な有害事象の報告/文書化 この研究中に発生したすべての重篤な有害事象は、研究に関連するとみなされるかどうかにかかわらず、症例記録フォームの「有害事象」ページに文書化されなければなりません。

重大な出来事に関して得られたすべての新しい情報を含む追跡報告書を作成し、収集する必要があります。

研究者は、要求に応じてこれらすべての報告書のコピーを倫理委員会に提出します。 必要に応じて、捜査官は当局に通知します。

6.3.2 重篤でない有害事象の報告/文書化 これらは、症例記録フォームの「有害事象」ページに文書化されます。

7 統計分析 これらの分析は、健康な個人、アトピー性個人、および喘息患者の間の縦方向の鼻サイトカイン軌道における統計的に有意な差異を調査することを目的としています。 まず、基本的な記述統計に取り組みます。 被験者の特徴 (例: 健康状態、人口動態変数）と結果変数（例: 鼻からのサイトカイン放出、臨床反応）は、各被験者グループ（健康な個人、アトピー性個人、喘息患者）の計量変数の最大、最小、中央値、平均、標準偏差とカテゴリ変数の絶対頻度と相対頻度を計算することによって説明されます。

ベースラインからの対数変化をグループ間で比較し、各時点でグループ間の各ペア比較の t 検定を使用して、経時的な軌跡の形状を調査します。 グラフで説明するために、各患者の個別の対数ベースライン変化軌跡と、95% CI のグループ平均がプロットされます。

ベースラインからの対数変化が合理的な線形性を示している場合は、反復測定の個人内相関を考慮して、被験者固有のランダム切片を含む混合線形モデルを使用して、被験者グループと縦方向の軌跡の間の関連性をテストし、グループ化します。時間相互作用項を使用して、軌跡の統計的に有意な差をテストします。 この混合モデリング アプローチの動機は、複数の時点にわたる情報を組み合わせることで検出力を高めることです。混合モデリング作業によって推定された平均軌跡と 95% CI もプロットされます。

8 倫理的および法的側面 研究は、現地の法的要件および GCP に従って実施されます。 現在の改訂を含むヘルシンキ宣言（1964 年）のガイドラインに従って実施されます。

8.1 被験者のインフォームドコンセント 被験者は、治験への参加を許可される前に、臨床研究の性質、範囲、起こり得る結果について理解できる形式で説明された後、参加に同意しなければなりません。 被験者は書面で同意を与える必要があります。 研究者の署名により被験者の同意が確認されます。 患者は、たとえコメントをしなくても、将来の医療に悪影響を及ぼすことなく、いつでも同意を撤回することができます。 経鼻吸収および/または RNA および/または血液サンプルは、分析のために匿名化された形式でオーストリア国外の協力パートナーに送信される場合があります (例: 英国ケンブリッジのアストラゼネカによる切断型および全体の IL-33 の分析）。 患者様にはインフォームドコンセントフォームにてこの旨を説明させていただきます。

8.2 研究の承認/承認 研究の開始前に、研究計画書はウィーン医科大学およびウィーン総合病院（Borschkegasse 8b/E 06、1090 Vienna、Austria）の倫理委員会に提出されます。

8.3 保険 この研究に参加するすべての被験者は、チューリッヒ保険会社 (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienna, Tel.) で保険に加入します。 +43 50 1255 1255)。

8.4 機密保持 すべての被験者の名前は研究者のファイル内で秘密に保たれます。 被験者は、文書化と評価を通じて、研究中に割り当てられた番号によって識別されます。 被験者には、すべての研究結果は極秘に保管され、取り扱われることが伝えられます。

9 研究結果の文書化と使用 9.1 研究結果の文書化 研究中に収集されたすべての結果はソース データ ファイルに収集され、後で症例報告フォーム (CRF) に転送されます。 症例記録用紙へのすべての記入は、黒または青のインクで読みやすく行われます。 症例記録フォームの入力内容に修正が加えられた場合、単語や数字が丸くなり、一筆書きで表示されます。 古いエントリと日付の横に正しい値が入力され、修正が初期化されます。 間違った入力内容を修正液で覆ったり、消したり、判読不能にしたりしてはなりません。 完成した CRF には治験責任医師が署名します。 CRF は最終試験の直後に完了します。 CRF の基礎となる医療記録は、少なくとも 15 年間保管されます。

9.2 研究結果の利用 この研究の結果は、研究者によって科学雑誌に掲載され、学術会議で発表されます。 原稿は提出前にすべての共同研究者に回覧されます。

研究参加者にとっての潜在的なリスクと利益および用量の選択に関する 10 の考慮事項

参加者はこの研究から直接利益を得ることはありません。 しかし、機械的粘膜刺激の動態はまだ完全には理解されていないため、この包括的なパイロット研究は、できれば新しい治療標的の発見につながる将来の研究を導く機会を提供するでしょう。

参加者にとっての潜在的なリスクには、採血部位の痛み、感染症、血腫などが含まれます。 鼻粘膜や分泌物の採取中に軽い鼻出血が起こる可能性があります。 SPT 中は、可能性は非常に低いですが、アナフィラキシー反応が発生する可能性があります。 アナフィラキシー反応のリスクを最小限に抑え、アナフィラキシー反応が発生した場合に最適な治療を提供するために、患者はSPT後少なくとも30分間モニタリングされます。 参加者の訪問には常に訓練を受けた担当者が配置され、緊急薬が常に用意されています。