Cinetica delle risposte delle citochine nasali alla stimolazione meccanica

La rinite allergica (AR) e l'asma allergico sono manifestazioni comuni dell'allergia di tipo I, una malattia da ipersensibilità IgE-mediata che si stima colpisca fino al 40% della popolazione mondiale. L'IgE è prodotta dalle cellule B e si lega alla superficie dei mastociti e dei basofili tramite il suo recettore Fce ad alta affinità I (FceRI). La reticolazione delle IgE di superficie mediante il suo allergene specifico induce la degranulazione delle cellule e il rilascio di mediatori dell'infiammazione. Questo processo che si sviluppa nel giro di pochi minuti porta ai tipici sintomi oculari, nasali e polmonari dell'AR e dell'asma come prurito, arrossamento degli occhi, naso che cola e/o congestionato e respiro sibilante dovuto all'intrappolamento dell'aria dovuto all'ostruzione delle vie aeree inferiori. Alcuni pazienti possono anche sviluppare reazioni di fase tardiva (LPR). Queste risposte si sviluppano tipicamente 2-6 ore dopo l'esposizione all'allergene, con un picco di intensità tra 6-9 ore e sono per lo più caratterizzate da edema tissutale che si manifesta come ostruzione del flusso aereo nelle vie aeree.

Dall'introduzione di dispositivi di campionamento dei fluidi della mucosa facili da usare e altamente assorbenti, negli ultimi anni sono stati ben caratterizzati i mediatori coinvolti nelle risposte allergiche della fase immediata e tardiva e la cinetica del loro rilascio. Gli sforzi dell'Imperial College di Londra e i dati non pubblicati del gruppo di ricercatori di Vienna hanno dimostrato che i mediatori chiave coinvolti nella fase immediata includono mediatori derivati ​​dai mastociti (triptasi, PGD2), allarmi epiteliali (IL-33, sST2) e complemento (C3a , C4a, C5a, D-Dimero). I mediatori coinvolti nelle reazioni di fase tardiva includono anche allarmine (sST2, TSLP), citochine Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), mediatori dei neutrofili (MMP-9) e mediatori degli eosinofili (EDN).

Tuttavia, ciò che recentemente è diventato chiaro anche attraverso studi controllati con placebo è che alcuni mediatori sono mediati meccanicamente (osservazioni non pubblicate), essendo rilasciati nell'ambiente extracellulare come risultato del processo di campionamento stesso. Questo è di vitale interesse poiché capire quali citochine sono meccaniche e quali sono specifiche per gli allergeni aiuterà a guidare gli studi futuri che tenteranno di mirare a biomarcatori specifici per il trattamento o il monitoraggio della malattia. Per capire se il rilascio meccanico gioca un ruolo nella risposta patologica agli allergeni sarà necessario studiare diverse coorti di pazienti per vedere se le loro risposte differiscono in qualche modo.

Razionale dello studio

Alla luce di ciò, i ricercatori propongono uno studio per studiare gli effetti del campionamento della mucosa sul rilascio di citochine dall'epitelio nasale. I ricercatori hanno in programma di campionare diverse coorti di pazienti (rinite allergica, asma allergico, non allergico) per vedere come gli effetti meccanici sono influenzati dal campionamento e dallo stato allergico o non allergico. Includendo 10 pazienti in ciascun gruppo, i ricercatori sperano di stabilire un intervallo "normale" per il rilascio meccanico di citochine rilevanti per gli allergeni in ciascun gruppo di studio che contribuirà a informare gli studi futuri che indagano sulle risposte specifiche all'allergene. Al fine di mappare sia le risposte sintomatiche che quelle obiettive al campionamento delle vie aeree, verranno utilizzati punteggi dei sintomi e misuratori di flusso delle vie aeree. Per mappare la cinetica delle risposte, i partecipanti saranno sottoposti a un corso temporale di campionamento della mucosa nel corso di un periodo di 8 ore in un solo giorno. Poiché non vengono fornite sostanze interventistiche, questo studio comporterà un rischio molto basso per le persone coinvolte, gettando luce importante sulle risposte epiteliali alla manipolazione meccanica.

Disegno dello studio In questo studio pilota monocentrico, un totale di 36 pazienti (n=12 per gruppo) saranno reclutati su base volontaria e riceveranno tutti un prelievo nasale. I partecipanti allo studio saranno sottoposti al prelievo nasale in un'unica visita.

Visita di selezione

Procedura:

• Firma del modulo di consenso informato
• Assegnazione del numero di screening
• Dati demografici
• Storia di allergia
• Valutazione dei criteri di inclusione ed esclusione
• Test di gravidanza per le donne se richiedono SPT
• Storia medica
• I pazienti che riferiscono una storia di asma dovranno fornire prove obiettive di ostruzione e reversibilità delle vie aeree (reversibilità della spirometria o PC20 metacolina/istamina <8mg)
• Farmaci concomitanti
• Rinoscopia anteriore
• SPT standard con estratto commerciale di: nocciolo, frassino, erba mista, ambrosia, artemisia, D. pteronyssinus, D. farina, forfora di cane e gatto, alternaria, cladosporium, istamina e controllo negativo
• Prelievo di sangue (max 60 ml di sangue eparinizzato e siero) - Una parte del campione di sangue verrà inviata direttamente al laboratorio per l'analisi delle IgE totali e delle IgE specifiche agli allergeni rilevanti. Dal resto del sangue, l'RNA sarà preparato e conservato a -80°C e il siero sarà separato e conservato a -20°C.
• prelievo nasale (prelievo di curette mucose e prelievo di secrezioni nasali)

Visita di campionamento

Procedura:

• Rivalutazione dei criteri di inclusione ed esclusione (risultati IgE allergene-specifici)
• Registrazione di farmaci concomitanti
• Prelievo di sangue al basale
• Raccolta di campioni nasali al basale per entrambe le narici (campionamento delle secrezioni nasali) a 0 min
• Punteggio TNSS di base
• PNIF di base
• Registrazione di eventi avversi (AE).

• Sangue, PNIF, campionamento nasale (entrambe le narici: campionamento della curette della mucosa e campionamento della secrezione nasale) e punteggio TNSS, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min, 360 min, 420 min, 480 min dopo l'inizio del tempo di campionamento

  4 Procedure di studio

4.1 Anamnesi medica dei partecipanti, dati demografici, farmaci concomitanti Ai partecipanti verrà chiesta la loro storia medica inclusi i dati demografici e i farmaci concomitanti, i loro sintomi allergici inclusa l'intensità e la durata e la loro storia medica allergica.

4.2 Anamnesi di allergia e punteggio TNSS Ai partecipanti verrà chiesto di indicare la presenza di starnuti, rinorrea, prurito nasale, congestione nasale e di classificare ciascun sintomo. Useranno il seguente metodo di punteggio dei sintomi: 0 = assente; 1 = lieve - presente ma facilmente tollerato; 2 = moderato - presente, il sintomo è fastidioso ma non interferisce con le attività della vita quotidiana; 3 = grave - il sintomo è difficile da tollerare e interferisce con le attività della vita quotidiana.

4.3 Rinoscopia anteriore La rinoscopia anteriore verrà eseguita una volta durante la visita di screening per escludere variazioni anatomiche (ad es. deviazione del setto) o alterazioni patologiche (ad es. polipi nasali). Verrà eseguito utilizzando uno speculum con il paziente seduto con la testa leggermente indietro.

4.4 Misuratore di flusso nasale inspiratorio di picco (PNIF) La portabilità e la facilità del PNIF offrono un'opportunità unica per ottenere misurazioni oggettive. Recentemente è stato anche validato come strumento di studio durante il test con allergeni nasali.

4.4.1 Procedura: Il PNIF utilizza un tubo di diametro variabile tarato direttamente in litri al minuto insieme ad un anello indicatore a bassa inerzia. La posizione dell'anello dopo una manovra inspiratoria indica il flusso massimo raggiunto. Il dispositivo funziona quando un paziente inala attraverso la bocca o il naso, questo fa sì che l'aria venga aspirata attraverso il misuratore e un cursore si sposta lungo la scala per indicare la velocità di inalazione. La portata raggiunta può essere rilevata controllando la posizione del cursore rispetto alla scala graduata.

4.4.2 PNIF nella condotta dello studio: i partecipanti verranno formati su come utilizzare il PNIF il giorno dello studio e quindi verrà utilizzato in tutti i momenti dello studio per ottenere informazioni sul flusso nasale.

4.5 Skin prick test 4.5.1 Procedura: Gli allergeni vengono inseriti nel derma dell'avambraccio pungendo delicatamente la pelle attraverso una goccia (20 ul) di una soluzione contenente allergene con una lancetta sterile con almeno 2 cm tra ogni singolo punto di applicazione. La soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% verrà utilizzata come controllo negativo e l'istamina come controllo positivo. In soggetti precedentemente sensibilizzati, entro 15 minuti dal contatto con il rispettivo allergene si verificheranno gonfiore pruriginoso e arrossamento della pelle (pomfo e reazione riacutizzata). Dopo 20 minuti, le soluzioni allergeniche verranno rimosse e i margini dei pomfi verranno tracciati con una penna a sfera. Sulla pelle verrà incollato del nastro trasparente per trasferire il contorno del pomfo al nastro per le registrazioni. La superficie dei pomfi sarà calcolata mediante planimetria digitale. Per l'inclusione, pomfi di almeno 3 mm di diametro saranno considerati reazioni positive.

4.5.2 Soluzioni di test: durante la visita di screening verrà utilizzato un pannello disponibile in commercio di polline di alberi ed erba, erbe infestanti e allergeni perenni (Allergopharma, Vienna, Austria) e verrà conservato secondo le istruzioni del produttore. Come controlli, verranno utilizzate una soluzione sterile di NaCl allo 0,9% (controllo negativo) e istamina (controllo positivo, Allergopharma, Vienna, Austria). Saranno conservati secondo le istruzioni del produttore.

4.5.3 SPT nella conduzione dello studio:

Visita di screening:

Verrà eseguito un prick test cutaneo standard con estratto di polline di betulla commerciale e un pannello di polline di alberi ed erbe, erbe infestanti e allergeni perenni (tutti Allergopharma, Vienna, Austria) utilizzati nella diagnostica di routine nella clinica allergica del reparto ORL per valutare il profilo di sensibilizzazione dei partecipanti alla visita di screening.

4.5.4 Precauzioni di sicurezza Come precauzione di sicurezza, i partecipanti saranno monitorati per 30 minuti dopo il test. Tutte le indagini verranno eseguite nell'ambulatorio del reparto ORL, dove sono disponibili attrezzature di emergenza complete.

4.6 Prelievo di sangue e misurazione dei parametri immunologici I campioni di sangue saranno prelevati alla visita di screening ea tutte le visite dello studio mediante puntura della vena antecubitale prima del test cutaneo. Verranno prelevati un massimo di 60 ml per visita eparinizzati (ad es. per i test di sensibilità dei basofili) o per la preparazione del siero (ad es. per la valutazione dei livelli di immunoglobuline totali e allergene-specifiche o per il test RBL). Le fiale di siero saranno processate e il siero sarà conservato a -20°C. Le IgE allergene-specifiche dei campioni di sangue della visita di screening saranno misurate mediante CAP-FEIA per valutare la classe RAST allergene-specifica dei pazienti. La misurazione delle IgE, IgG, IgA e IgM sieriche totali, libere e allergene-specifiche sarà eseguita mediante CAP-FEIA, mediante misurazione con microarray o ELISA. I mediatori immunitari saranno misurati utilizzando la piattaforma MSD da noi o dai nostri collaboratori di AstraZeneca, Cambridge, Regno Unito. La misurazione verrà eseguita alla fine dello studio in tutti i campioni di siero raccolti per ridurre al minimo la variazione interdosaggio.

4.7 Test di gravidanza Nelle partecipanti di sesso femminile, la gravidanza sarà esclusa con un test di gravidanza standard sulle urine. Il test verrà eseguito prima del primo skin prick test alla visita di screening e successivamente una volta al mese.

4.8 Prelievo di campioni nasali Il prelievo di campioni nasali sarà eseguito a tutte le visite. Per ogni visita, i campioni verranno raccolti utilizzando il nasosorbimento FXi/PU (contenente una matrice assorbente sintetica (SAM)) o una curette di plastica lunga 10 cm (dispositivi di nasoassorbimento di Hunt Developments, Regno Unito) (dispositivi di curette di Arlington Scientific, USA)

4.8.1 Nasosorbimento mediante FXi/PU (Hunt Developments, Regno Unito). Sotto visualizzazione, il dispositivo verrà inserito nella cavità nasale e posizionato lungo la parete laterale contro il turbinato inferiore. Il dito indice del paziente verrà utilizzato per premere sugli aspetti esterni delle cartilagini nasali alare e laterale per tenere il dispositivo in posizione. Dopo 1 minuto, i dispositivi verranno rimossi e quindi congelati a -80°C.

4.8.2 Campionamento dell'mRNA della mucosa Verrà utilizzata una curette nasale da 10 cm (Rhino-Probe, Arlington Scientific, USA o Cellskim, Hunt Developments, UK). Sotto visualizzazione diretta la curette verrà portata ad appoggiarsi alla porzione medio-inferiore del turbinato inferiore. La curette verrà premuta contro la superficie della mucosa spostata verso l'esterno 2-3 volte. Questo movimento verrà ripetuto 2-3 volte per garantire una buona raccolta del campione. È stato dimostrato che questa curette e questa tecnica non causano disagio significativo ai partecipanti e quindi hanno il vantaggio di non richiedere anestesia locale. Dopo la raccolta, le cellule saranno lisate nel tampone Qiagen RLT e conservate a -80°C per la successiva analisi dell'mRNA.

5 Prodotti sperimentali e farmaci dello studio 5.3 Farmaci concomitanti 5.3.1 Generale Tutti i farmaci aggiuntivi assunti dai soggetti all'ingresso nello studio o in qualsiasi momento durante lo studio sono considerati farmaci concomitanti e saranno documentati nel CRF. I farmaci concomitanti devono essere ridotti al minimo durante lo studio, ma se ritenuto necessario possono essere somministrati se non interferiscono con il protocollo dello studio.

5.3.2 Farmaci di salvataggio Sebbene gli eventi anafilattici siano molto improbabili in questo studio, devono sempre essere considerati possibili. Pertanto sarà immediatamente disponibile un kit di emergenza completo in caso di reazioni anafilattiche presso SPT. Inoltre, se il partecipante soffre di forti sintomi cutanei dopo l'SPT, verrà fornita desloratadina 5 mg per migliorare i sintomi.

5.3.3 Farmaci concomitanti vietati

I soggetti devono rimanere senza farmaci che interferiscono con le procedure dello studio per tutta la durata dello studio. I seguenti trattamenti concomitanti non sono consentiti durante questo studio:

• Corticosteroidi sistemici o topici
• Altri farmaci immunosoppressori
• Antistaminici o cromoglicato disodico 3 giorni prima della visita di screening
• Farmaci adrenergici sistemici o intranasali
• Psicofarmaci

• ACE-inibitori o beta-bloccanti

  6 Eventi avversi Un evento avverso è qualsiasi evento verificatosi nel corso di uno studio clinico, comprese malattie intercorrenti o incidenti, che pregiudichi il benessere del soggetto; può anche assumere la forma di un valore di laboratorio anomalo. Il termine evento avverso non implica una relazione causale con il trattamento in studio.

Tutti i soggetti che manifestano eventi avversi - considerati o meno associati all'uso del trattamento in studio - saranno monitorati fino alla scomparsa dei sintomi e fino a quando qualsiasi valore di laboratorio anomalo non sarà tornato al basale, o fino a quando non vi sarà una spiegazione soddisfacente per i cambiamenti osservati, o fino alla morte , nel qual caso verrà fornito un referto patologico completo di un patologo qualificato. Tutti i risultati devono essere riportati su una pagina "evento avverso" nel modulo di registrazione del caso.

Tutti gli eventi avversi saranno segnalati e documentati come descritto di seguito. Gli eventi avversi sono suddivisi nelle categorie "gravi" e "non gravi". Questo determina la procedura che deve essere utilizzata per segnalare/documentare l'evento avverso (vedi sotto).

6.1 Definizione di eventi avversi gravi e non gravi

Un evento avverso grave è:

• Qualsiasi evento fatale o pericoloso per la vita
• Qualsiasi evento che viene disabilitato in modo permanente
• Qualsiasi evento che richieda o prolunghi il ricovero
• Qualsiasi evento che comporti cancro, anomalie congenite o si verifichi a seguito di sovradosaggio (applicazione di una dose superiore a quella stabilita).

Gli eventi avversi che non rientrano in queste categorie sono definiti non gravi.

6.2 Valutazione della gravità dell'EA

Indipendentemente dalla classificazione di un evento avverso come grave o non grave (vedi sopra), la sua gravità deve essere valutata come lieve, moderata o grave, secondo i soli criteri medici:

Lieve = non interferisce con le attività di routine, accettabile Moderato = interferisce con le attività di routine Grave = impossibile eseguire le attività di routine, considerato inaccettabile dal medico, richiede un trattamento, richiede l'interruzione dello studio o ha un effetto residuo.

Va notato che un evento avverso grave non deve necessariamente essere di natura grave. Indipendentemente dalla gravità, tutti gli eventi avversi gravi devono essere segnalati come di seguito.

6.3 Segnalazione/documentazione degli eventi avversi Gli eventi avversi sono raccolti mediante segnalazione spontanea. 6.3.1 Segnalazione/documentazione di eventi avversi gravi Tutti gli eventi avversi gravi che si verificano durante questo studio, considerati o meno associati allo studio, devono essere documentati su una pagina "Eventi avversi" nel modulo di registrazione del caso.

Deve essere preparato e raccolto un rapporto di follow-up che includa tutte le nuove informazioni ottenute sull'evento grave.

Lo sperimentatore presenterà su richiesta copie di tutti questi rapporti al comitato etico. Ove necessario, gli investigatori informeranno le autorità.

6.3.2 Segnalazione/documentazione di eventi avversi non gravi Questi devono essere documentati su una pagina "Eventi avversi" nel modulo di registrazione del caso.

7 Analisi statistica Queste analisi cercheranno di esplorare eventuali differenze statisticamente significative nelle traiettorie longitudinali delle citochine nasali tra individui sani, individui atopici e asmatici. Per prima cosa ci occuperemo delle statistiche descrittive di base. Caratteristiche del soggetto (es. stato di salute, variabili demografiche) e variabili di esito (ad es. rilascio nasale di citochine, risposte cliniche) saranno descritte calcolando massimo, minimo, mediano, media e deviazione standard per le variabili metriche e le frequenze assolute e relative per le variabili categoriali per ciascun gruppo di soggetti (soggetti sani, soggetti atopici e asmatici).

Le modifiche logaritmiche rispetto alla linea di base saranno confrontate tra i gruppi e in ogni punto temporale utilizzando t-test per ogni confronto a coppie tra i gruppi, per esplorare la forma delle traiettorie nel tempo. Per l'illustrazione grafica, verranno tracciate le singole traiettorie di variazione log-baseline di ciascun paziente, nonché le medie di gruppo con IC al 95%.

Se le modifiche logaritmiche rispetto alla linea di base mostrano una ragionevole linearità, testeremo un'associazione tra gruppi di soggetti e traiettorie longitudinali utilizzando modelli lineari misti con intercettazioni casuali specifiche del soggetto per tenere conto delle correlazioni intra-individuali di misure ripetute e raggruppare per termini di interazione temporale per testare differenze statisticamente significative nelle traiettorie. La motivazione di questo approccio di modellazione mista sarà quella di aumentare la potenza combinando le informazioni attraverso più punti temporali. Verranno tracciate anche le traiettorie medie e gli IC al 95% dedotti dal lavoro di modellazione mista

8 Aspetti etici e legali Lo studio sarà condotto in conformità con i requisiti legali locali e GCP. Sarà eseguito in conformità con le linee guida della Dichiarazione di Helsinki (1964), comprese le revisioni attuali.

8.1 Consenso informato del soggetto Prima di essere ammesso allo studio, il soggetto deve aver acconsentito a partecipare dopo che la natura, la portata e le possibili conseguenze dello studio clinico sono state spiegate in una forma a lui comprensibile. Il soggetto deve dare il consenso per iscritto. La firma dello sperimentatore confermerà il consenso del soggetto. Il paziente può revocare il consenso, anche senza esprimere osservazioni, in qualsiasi momento e senza conseguenze negative per le sue future cure mediche. Nasosorbimento e/o RNA e/o campioni di sangue possono essere inviati in forma anonima a partner di collaborazione al di fuori dell'Austria per l'analisi (ad es. analisi di IL-33 tagliata e intera da parte di AstraZeneca, Cambridge UK). Il paziente viene informato di ciò nel modulo di consenso informato.

8.2 Riconoscimento/approvazione dello studio Prima dell'inizio dello studio, il protocollo dello studio sarà sottoposto al comitato etico dell'università medica di Vienna e dell'ospedale generale di Vienna (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Vienna, Austria).

8.3 Assicurazione Tutti i soggetti che partecipano a questo studio saranno assicurati presso la compagnia assicurativa di Zurigo (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienna, Tel. +43 50 1255 1255).

8.4 Riservatezza I nomi di tutti i soggetti saranno tenuti segreti negli archivi degli investigatori. I soggetti saranno identificati in tutta la documentazione e la valutazione in base al numero loro assegnato durante lo studio. Ai soggetti verrà detto che tutti i risultati dello studio saranno archiviati e gestiti con la massima riservatezza.

9 Documentazione e utilizzo dei risultati dello studio 9.1 Documentazione dei risultati dello studio Tutti i risultati raccolti durante lo studio saranno raccolti in un file di dati di origine e saranno successivamente trasferiti nei moduli di segnalazione dei casi (CRF). Tutte le voci sui moduli di registrazione dei casi saranno redatte in modo leggibile con inchiostro nero o blu. Se vengono apportate correzioni alle voci nel modulo di registrazione del caso, le parole o le cifre saranno circondate da un unico tratto. Il valore corretto verrà inserito accanto alla vecchia voce e data e la correzione verrà siglata. Le voci errate non devono essere coperte con liquido correttore o cancellate o rese illeggibili in alcun modo. I CRF completati saranno firmati dallo sperimentatore. I CRF saranno completati immediatamente dopo l'esame finale. Le cartelle cliniche su cui si basa il CRF saranno conservate per almeno 15 anni.

9.2 Utilizzo dei risultati dello studio I risultati di questo studio saranno pubblicati dai ricercatori in una rivista scientifica e presentati in convegni scientifici. Il manoscritto sarà distribuito a tutti i co-ricercatori prima dell'invio.

10 Considerazioni sui potenziali rischi e benefici per i partecipanti allo studio e selezione della dose

I partecipanti inclusi non beneficeranno direttamente dello studio. Tuttavia, poiché la cinetica della stimolazione meccanica della mucosa non è ancora completamente compresa, questo studio pilota completo offrirà l'opportunità di guidare la ricerca futura che, si spera, porterà alla scoperta di nuovi bersagli terapeutici.

I potenziali rischi per i partecipanti includono dolore, infezione ed ematoma nel sito del prelievo di sangue. Durante il campionamento della mucosa nasale e delle secrezioni, un leggero sanguinamento nasale è un possibile rischio. Durante SPT, sebbene altamente improbabile, le reazioni anafilattiche sono una possibilità. Per ridurre al minimo il rischio di reazioni anafilattiche e per fornire un trattamento ottimale nel caso in cui si verifichi una reazione anafilattica, i pazienti saranno monitorati per un minimo di 30 minuti dopo SPT. A tutte le visite dei partecipanti sarà sempre disponibile personale addestrato e farmaci di emergenza.