Cinética de las respuestas de citoquinas nasales a la estimulación mecánica

La rinitis alérgica (RA) y el asma alérgica son manifestaciones comunes de la alergia de tipo I, una enfermedad de hipersensibilidad mediada por IgE que se estima afecta hasta al 40 % de la población mundial. La IgE es producida por las células B y se une a la superficie de los mastocitos y basófilos a través de su receptor I Fce de alta afinidad (FceRI). El entrecruzamiento de la IgE de superficie por su alérgeno específico induce la desgranulación de las células así como la liberación de mediadores inflamatorios. Este proceso que se desarrolla en minutos conduce a los síntomas oculares, nasales y pulmonares típicos de la AR y el asma, como picazón, enrojecimiento de los ojos, secreción y/o congestión nasal y sibilancias debido al atrapamiento de aire como resultado de la obstrucción de las vías respiratorias inferiores. Algunos pacientes también pueden desarrollar reacciones de fase tardía (LPR). Estas respuestas generalmente se desarrollan de 2 a 6 horas después de la exposición al alérgeno, alcanzan su punto máximo de intensidad entre 6 y 9 horas y se caracterizan principalmente por edema tisular que se manifiesta como obstrucción del flujo de aire en las vías respiratorias.

Desde la introducción de dispositivos de muestreo de fluidos mucosos fáciles de usar y altamente absorbentes, los mediadores involucrados en las respuestas alérgicas de fase inmediata y tardía y la cinética de su liberación se han caracterizado bien en los últimos años. Los esfuerzos del Imperial College London y los datos no publicados del grupo de investigadores en Viena han demostrado que los mediadores clave involucrados en la fase inmediata incluyen mediadores derivados de mastocitos (triptasa, PGD2), alarminas epiteliales (IL-33, sST2) y complemento (C3a , C4a, C5a, Dímero-D). Los mediadores involucrados en las reacciones de fase tardía también incluyen alarminas (sST2, TSLP), citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), mediadores de neutrófilos (MMP-9) y mediadores de eosinófilos (EDN).

Sin embargo, lo que también ha quedado claro recientemente a través de estudios controlados con placebo es que algunos mediadores están mediados mecánicamente (observaciones no publicadas), y se liberan en el entorno extracelular como resultado del propio proceso de muestreo. Esto es de vital interés, ya que comprender qué citoquinas son mecánicas y cuáles son específicas de alérgenos ayudará a guiar futuros estudios que intenten apuntar a biomarcadores específicos para el tratamiento o el control de enfermedades. Para comprender si la liberación mecánica juega algún papel en la respuesta patológica a los alérgenos, será necesario investigar diferentes cohortes de pacientes para ver si sus respuestas difieren de alguna manera.

Racional del Estudio

A la luz de esto, los investigadores proponen un estudio para investigar los efectos del muestreo de la mucosa en la liberación de citoquinas del epitelio nasal. Los investigadores planean tomar muestras de diferentes cohortes de pacientes (rinitis alérgica, asma alérgica, no alérgica) para ver cómo los efectos mecánicos se ven influenciados por la muestra y el estado alérgico o no alérgico. Al incluir 10 pacientes en cada grupo, los investigadores esperan establecer un rango "normal" para la liberación mecánica de citocinas relevantes para alérgenos en cada grupo de estudio, lo que ayudará a informar futuros estudios que investiguen las respuestas específicas de alérgenos. Para mapear las respuestas sintomáticas y objetivas al muestreo de las vías respiratorias, se emplearán puntajes de síntomas y medidores de flujo de las vías respiratorias. Para mapear la cinética de las respuestas, los participantes se someterán a un curso de tiempo de muestreo de la mucosa en el transcurso de un período de 8 horas en un solo día. Dado que no se administran sustancias de intervención, este estudio conllevará un riesgo muy bajo para las personas involucradas y arrojará luz importante sobre las respuestas epiteliales a la manipulación mecánica.

Diseño del estudio En este estudio piloto de un solo centro, un total de 36 pacientes (n=12 por grupo) serán reclutados de forma voluntaria y todos recibirán muestras nasales. Los participantes del estudio se someterán al muestreo nasal en una sola visita.

Visita de selección

Procedimiento:

• Firma del Consentimiento Informado
• Asignación de número de cribado
• Datos demográficos
• Historia de la alergia
• Evaluación de los criterios de inclusión y exclusión
• Prueba de embarazo para mujeres si requiere SPT
• Historial médico
• Los pacientes que informen antecedentes de asma deberán proporcionar evidencia objetiva de obstrucción de las vías respiratorias y reversibilidad (reversibilidad de la espirometría o PC20 metacolina/histamina <8 mg)
• Medicación concomitante
• rinoscopia anterior
• SPT estándar con extracto comercial de: avellano, fresno, mezcla de hierbas, ambrosía, artemisa, D. pteronyssinus, D. farina, caspa de perro y gato, alternaria, cladosporium, histamina y control negativo
• Muestreo de sangre (máx. 60 ml de sangre heparinizada y suero): una parte de la muestra de sangre se enviará directamente al laboratorio para el análisis de IgE total e IgE específica para los alérgenos relevantes. Del resto de la sangre se preparará el ARN y se almacenará a -80°C y el suero se separará y almacenará a -20°C.
• muestreo nasal (muestreo de cureta mucosa y muestreo de secreciones nasales)

Visita de muestreo

Procedimiento:

• Reevaluación de los criterios de entrada y exclusión (resultados de IgE específica de alérgeno)
• Registro de medicación concomitante
• Muestreo de sangre de referencia
• Recolección de muestras nasales de referencia para ambas fosas nasales (muestreo de secreciones nasales) a los 0 minutos
• Puntuación TNSS inicial
• PNIF basal
• Registro de eventos adversos (EA)

• Sangre, PNIF, muestra nasal (ambas fosas nasales: muestra de cureta mucosa y muestra de secreción nasal) y puntuación TNSS, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min, 360 min, 420 min, 480 min después del inicio del transcurso del tiempo de muestreo

  4 Procedimientos de estudio

4.1 Historial médico de los participantes, datos demográficos, medicación concomitante Se solicitará a los participantes su historial médico incluyendo datos demográficos y medicación concomitante, sus síntomas alérgicos incluyendo intensidad y duración y su historial de medicación alérgica.

4.2 Historial de alergia y puntuación TNSS Se preguntará a los participantes sobre la aparición de estornudos, rinorrea, prurito nasal, congestión nasal y la calificación de cada síntoma. Usarán el siguiente método de puntuación de síntomas: 0 = ausente; 1 = leve - presente pero fácilmente tolerado; 2 = moderado - presente, el síntoma es molesto pero no interfiere con las actividades de la vida diaria; 3 = grave: el síntoma es difícil de tolerar e interfiere con las actividades de la vida diaria.

4.3 Rinoscopia anterior La rinoscopia anterior se realizará una vez durante la visita de selección para excluir variaciones anatómicas (p. desviación septal) o cambios patológicos (p. pólipos nasales). Se realizará utilizando un espéculo con el paciente sentado con la cabeza ligeramente hacia atrás.

4.4 Medidor de flujo nasal inspiratorio máximo (PNIF) La portabilidad y facilidad del PNIF brinda una oportunidad única para obtener mediciones objetivas. También se ha validado recientemente como una herramienta de estudio durante la provocación con alérgenos nasales.

4.4.1 Procedimiento: El PNIF utiliza un tubo de diámetro variable calibrado directamente en litros por minuto junto con un anillo indicador de baja inercia. La posición del anillo después de una maniobra inspiratoria indica el flujo máximo alcanzado. El dispositivo funciona cuando un paciente inhala por la boca o la nariz, esto hace que el aire pase por el medidor y un cursor se mueve a lo largo de la escala para indicar la velocidad de inhalación. La velocidad de flujo lograda se puede observar comparando la posición del cursor con la escala calibrada.

4.4.2 PNIF en la realización del estudio: los participantes recibirán capacitación sobre cómo usar el PNIF el día del estudio y luego se usará en todos los puntos de tiempo del estudio para obtener información sobre el flujo nasal.

4.5 Prueba de punción cutánea 4.5.1 Procedimiento: Los alérgenos se insertan en la dermis del antebrazo pinchando suavemente la piel con una gota (20 ul) de una solución que contiene alérgenos con una lanceta estéril con al menos 2 cm entre cada punto de aplicación individual. Se utilizará solución de cloruro de sodio al 0,9% como control negativo e histamina como control positivo. En personas previamente sensibilizadas, se producirá hinchazón con picazón y enrojecimiento de la piel (reacción de roncha y eritema) dentro de los 15 minutos posteriores al desafío con el alérgeno respectivo. Después de 20 minutos, se limpiarán las soluciones de alérgenos y se trazarán los márgenes de las ronchas con un bolígrafo. Se pegará cinta transparente sobre la piel para transferir el contorno de la roncha a la cinta para los registros. La superficie de las ronchas se calculará mediante planimetría digital. Para su inclusión, las ronchas de al menos 3 mm de diámetro se considerarán reacciones positivas.

4.5.2 Soluciones de prueba: En la visita de selección se utilizará un panel disponible comercialmente de polen de árboles y pastos, malezas y alérgenos perennes (Allergopharma, Viena, Austria) y se almacenará de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como controles, se utilizarán solución estéril de NaCl al 0,9 % (control negativo) e histamina (control positivo, Allergopharma, Viena, Austria). Se almacenarán de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4.5.3 SPT en la realización del estudio:

Visita de selección:

Para evaluar el perfil de sensibilización de los participantes en la visita de selección.

4.5.4 Precauciones de seguridad Como precaución de seguridad, los participantes serán monitoreados durante 30 minutos después de la prueba. Todas las investigaciones se realizarán en la Clínica ambulatoria del Departamento de Otorrinolaringología, donde se encuentra disponible el equipo de emergencia completo.

4.6 Muestreo de sangre y medición de parámetros inmunológicos Se tomarán muestras de sangre en la visita de selección y en todas las visitas de estudio mediante punción de la vena antecubital antes de la prueba cutánea. Se tomará un máximo de 60 ml por visita ya sea heparinizado (por ejemplo, para ensayos de sensibilidad de basófilos) o para la preparación de suero (por ejemplo, para la evaluación de los niveles de inmunoglobulina total y específica de alérgeno o ensayo RBL). Los viales de suero se procesarán y el suero se almacenará a -20 °C. CAP-FEIA medirá la IgE específica de alérgeno de las muestras de sangre de la visita de selección para evaluar la clase RAST específica de alérgeno de los pacientes. La medición de IgE, IgG, IgA e IgM séricas totales, libres y específicas de alérgenos se realizará mediante CAP-FEIA, mediante medición de microarrays o ELISA. Los mediadores inmunitarios serán medidos mediante la plataforma MSD por nosotros o por nuestros colaboradores en AstraZeneca, Cambridge, Reino Unido. La medición se realizará al final del estudio en todas las muestras de suero recolectadas para minimizar la variación entre ensayos.

4.7 Prueba de embarazo En las participantes femeninas, el embarazo se excluirá con una prueba de embarazo de orina estándar. La prueba se realizará antes de la primera prueba cutánea en la visita de selección y después una vez al mes.

4.8 Recolección de muestras nasales La recolección de muestras nasales se realizará en todas las visitas. En cada visita, las muestras se recolectarán utilizando nasosorción FXi/PU (que contiene una matriz de absorción sintética (SAM)), o una cureta de plástico de 10 cm de largo (dispositivos de nasosorción de Hunt Developments, Reino Unido) (Dispositivos de cureta de Arlington Scientific, EE. UU.)

4.8.1 Nasosorción utilizando FXi/PU (Hunt Developments, Reino Unido). Bajo visualización, el dispositivo se insertará en la cavidad nasal y se colocará a lo largo de la pared lateral contra el cornete inferior. El dedo índice del paciente se usará para presionar sobre los aspectos externos de los cartílagos nasales alares y laterales para mantener el dispositivo en su lugar. Después de 1 minuto, los dispositivos se retirarán y luego se congelarán a -80 °C.

4.8.2 Muestreo de ARNm de la mucosa Se utilizará una cureta nasal de 10 cm (ya sea Rhino-Probe, Arlington Scientific, EE. UU. o Cellskim, Hunt Developments, Reino Unido). Bajo visualización directa, la cureta se colocará contra la porción medioinferior del cornete inferior. La cureta se presionará contra la superficie de la mucosa y se moverá hacia afuera 2 o 3 veces. Este movimiento se repetirá 2 o 3 veces para garantizar una buena recolección de muestras. Se ha demostrado que esta cureta y esta técnica no causan molestias significativas a los participantes y, por lo tanto, tienen la ventaja de que no requieren anestesia local. Después de la recolección, las células se lisarán en tampón Qiagen RLT y se almacenarán a -80 °C para su posterior análisis de ARNm.

5 Productos en investigación y medicación del estudio 5.3 Medicación concomitante 5.3.1 General Todos los medicamentos adicionales que toman los sujetos al ingresar al estudio o en cualquier momento durante el estudio se consideran medicamentos concomitantes y se documentarán en el CRF. Los medicamentos concomitantes deben reducirse al mínimo durante el estudio, pero si se considera necesario, se pueden administrar si no interfieren con el protocolo del estudio.

5.3.2 Medicación de rescate Aunque los eventos anafilácticos son muy poco probables en este estudio, siempre deben considerarse posibles. Por lo tanto, un kit de emergencia completo estará disponible de inmediato en caso de reacciones anafilácticas en SPT. Además, si el participante sufre fuertes síntomas en la piel después del SPT, se le proporcionarán 5 mg de desloratadina para mejorar los síntomas.

5.3.3 Medicamentos concomitantes prohibidos

Los sujetos deben permanecer sin medicamentos que interfieran con los procedimientos del estudio durante la duración del estudio. Los siguientes tratamientos concomitantes no están permitidos durante este estudio:

• Corticoides tópicos o sistémicos
• Otros medicamentos inmunosupresores
• Antihistamínicos o cromoglicato disódico 3 días antes de la visita de selección
• Fármacos adrenérgicos sistémicos o intranasales
• Medicamentos psicofarmacológicos

• Inhibidores de la ECA o bloqueadores beta

  6 Eventos adversos Un evento adverso es cualquier evento durante un estudio clínico, incluidas enfermedades o accidentes intercurrentes, que perjudica el bienestar del sujeto; también puede tomar la forma de un valor de laboratorio anormal. El término evento adverso no implica una relación causal con el tratamiento del estudio.

Todos los sujetos que experimenten eventos adversos, ya sea que se consideren asociados con el uso del tratamiento del estudio o no, serán monitoreados hasta que los síntomas desaparezcan y cualquier valor de laboratorio anormal haya vuelto a la línea base, o hasta que haya una explicación satisfactoria para los cambios observados, o hasta la muerte. , en cuyo caso se proporcionará un informe patológico completo de un patólogo calificado. Todos los hallazgos deben informarse en una página de "eventos adversos" en el formulario de registro de casos.

Todos los eventos adversos se informarán y documentarán como se describe a continuación. Los eventos adversos se dividen en las categorías "graves" y "no graves". Esto determina el procedimiento que debe usarse para informar/documentar el evento adverso (ver más abajo).

6.1 Definición de eventos adversos graves y no graves

Un evento adverso grave es:

• Cualquier evento que sea fatal o que ponga en peligro la vida.
• Cualquier evento que inhabilite permanentemente
• Cualquier evento que requiera o prolongue la hospitalización
• Cualquier evento que involucre cáncer, anomalía congénita o que ocurra como resultado de una sobredosis (aplicación de más de la dosis estipulada).

Los eventos adversos que no entran en estas categorías se definen como no graves.

6.2 Evaluación de la gravedad del EA

Independientemente de la clasificación de un evento adverso como grave o no grave (ver arriba), su gravedad debe evaluarse como leve, moderada o grave, de acuerdo únicamente con el criterio médico:

Leve = no interfiere con las actividades rutinarias, aceptable Moderado = interfiere con las actividades rutinarias Severo = imposible realizar las actividades rutinarias, considerado inaceptable por el médico, requiere tratamiento, requiere la interrupción del estudio o tiene efecto residual.

Cabe señalar que un evento adverso grave no tiene por qué ser de naturaleza grave. Independientemente de la gravedad, todos los eventos adversos graves deben informarse como se indica a continuación.

6.3 Notificación/documentación de eventos adversos Los eventos adversos se recopilan mediante notificación espontánea. 6.3.1 Notificación/documentación de eventos adversos graves Todos los eventos adversos graves que ocurran durante este estudio, ya sea que se consideren asociados con el estudio o no, deben documentarse en una página de "Evento adverso" en el formulario de registro de casos.

Deberá elaborarse y se recogerá un informe de seguimiento que incluya toda la nueva información obtenida sobre el hecho grave.

El investigador presentará, previa solicitud, copias de todos estos informes al comité de ética. Cuando sea necesario, los investigadores informarán a las autoridades.

6.3.2 Notificación/documentación de eventos adversos no graves Deben documentarse en una página de "Evento adverso" en el formulario de registro de casos.

7 Análisis estadístico Estos análisis buscarán explorar cualquier diferencia estadísticamente significativa en las trayectorias longitudinales de citoquinas nasales entre individuos sanos, individuos atópicos y asmáticos. Primero realizaremos estadísticas descriptivas básicas. Características del sujeto (por ej. estado de salud, variables demográficas) y variables de resultado (p. liberación nasal de citocinas, respuestas clínicas) se describirá calculando el máximo, el mínimo, la mediana, la media y la desviación estándar de las variables métricas y las frecuencias absolutas y relativas de las variables categóricas para cada grupo de sujetos (personas sanas, personas atópicas y asmáticos).

Los cambios logarítmicos desde la línea de base se compararán entre grupos, y en cada momento utilizando pruebas t para cada comparación por pares entre grupos, para explorar la forma de las trayectorias a lo largo del tiempo. Para la ilustración gráfica, se trazarán las trayectorias individuales de cambio de la línea de base logarítmica de cada paciente, así como las medias grupales con IC del 95 %.

Si los cambios logarítmicos desde la línea de base exhiben una linealidad razonable, probaremos una asociación entre los grupos de sujetos y las trayectorias longitudinales utilizando modelos lineales mixtos con intersecciones aleatorias específicas del sujeto para tener en cuenta las correlaciones intraindividuales de medidas repetidas y agrupar por términos de interacción temporal para probar diferencias estadísticamente significativas en las trayectorias. La motivación de este enfoque de modelado mixto será aumentar el poder mediante la combinación de información en múltiples puntos de tiempo. También se representarán las trayectorias medias y los IC del 95 % según se deduce del trabajo de modelado mixto.

8 Aspectos éticos y legales El estudio se llevará a cabo de acuerdo con los requisitos legales locales y las BPC. Se realizará de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki (1964), incluidas las revisiones actuales.

8.1 Consentimiento informado del sujeto Antes de ser admitido en el estudio, el sujeto debe haber dado su consentimiento para participar después de que se le haya explicado la naturaleza, el alcance y las posibles consecuencias del estudio clínico de forma comprensible para él/ella. El sujeto debe dar su consentimiento por escrito. La firma del investigador confirmará el consentimiento del sujeto. El paciente puede retirar el consentimiento, incluso sin dar comentarios, en cualquier momento y sin consecuencias negativas para su futura atención médica. Las muestras de nasosorción y/o ARN y/o sangre pueden enviarse de forma anónima a socios colaboradores fuera de Austria para su análisis (p. análisis de IL-33 escindida y entera por AstraZeneca, Cambridge, Reino Unido). El paciente es informado sobre esto en el formulario de consentimiento informado.

8.2 Reconocimiento/aprobación del estudio Antes del inicio del estudio, el protocolo del estudio se presentará al comité de ética de la universidad médica de Viena y el hospital general de Viena (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Viena, Austria).

8.3 Seguro Todos los sujetos que participen en este estudio estarán asegurados en la compañía de seguros de Zürich (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Viena, tel. +43 50 1255 1255).

8.4 Confidencialidad Los nombres de todos los sujetos se mantendrán en secreto en los archivos de los investigadores. Los sujetos serán identificados a lo largo de la documentación y evaluación por el número que se les asignó durante el estudio. Se informará a los sujetos que todos los hallazgos del estudio se almacenarán y manejarán con la más estricta confidencialidad.

9 Documentación y uso de los hallazgos del estudio 9.1 Documentación de los hallazgos del estudio Todos los resultados recopilados durante el estudio se recopilarán en un archivo de datos fuente y luego se transferirán a los formularios de informes de casos (CRF). Todas las entradas en los formularios de registro de casos se harán de manera legible en tinta negra o azul. Si se hacen correcciones a las entradas en el formulario de registro de casos, las palabras o cifras se marcarán con un círculo y se trazará un solo trazo entre ellas. El valor correcto se ingresará junto a la entrada y la fecha anteriores y se inicializará la corrección. Las entradas incorrectas no deben cubrirse con líquido corrector ni borrarse o hacerse ilegibles de ninguna manera. Los CRF completados serán firmados por el investigador. Los CRF se completarán inmediatamente después del examen final. Los registros médicos en los que se basa el CRF se conservarán durante al menos 15 años.

9.2 Uso de los hallazgos del estudio Los hallazgos de este estudio serán publicados por los investigadores en una revista científica y presentados en reuniones científicas. El manuscrito se distribuirá a todos los coinvestigadores antes de su presentación.

10 Consideraciones sobre los riesgos y beneficios potenciales para los participantes del estudio y la selección de la dosis

Los participantes incluidos no se beneficiarán directamente del estudio. Sin embargo, dado que la cinética de la estimulación mecánica de la mucosa aún no se comprende por completo, este estudio piloto integral brindará la oportunidad de guiar futuras investigaciones que, con suerte, conducirán al descubrimiento de nuevos objetivos terapéuticos.

Los riesgos potenciales para los participantes incluyen dolor, infección y hematoma en el sitio de extracción de sangre. Durante el muestreo de la mucosa nasal y las secreciones, existe un posible riesgo de sangrado nasal leve. Durante SPT, aunque es muy poco probable, las reacciones anafilácticas son una posibilidad. Para minimizar el riesgo de reacciones anafilácticas y brindar un tratamiento óptimo en caso de que ocurra una reacción anafiláctica, los pacientes serán monitoreados durante un mínimo de 30 minutos después de la SPT. En todas las visitas de los participantes habrá personal capacitado y medicamentos de emergencia disponibles en todo momento.