Кинетика назальных цитокиновых ответов на механическую стимуляцию

Аллергический ринит (АР) и аллергическая астма являются частыми проявлениями аллергии типа I, IgE-опосредованного заболевания гиперчувствительности, которым, по оценкам, страдает до 40% населения мира. IgE продуцируется В-клетками и связывается с поверхностью тучных клеток и базофилов через высокоаффинный Fce-рецептор I (FceRI). Сшивание поверхностного IgE его специфическим аллергеном вызывает дегрануляцию клеток, а также высвобождение медиаторов воспаления. Этот процесс, который развивается в течение нескольких минут, приводит к типичным глазным, назальным и легочным симптомам АР и астмы, таким как зуд, покраснение глаз, насморк и/или заложенность носа и хрипы из-за захвата воздуха в результате обструкции нижних дыхательных путей. У некоторых пациентов могут также развиться реакции поздней фазы (LPR). Эти реакции обычно развиваются через 2-6 часов после воздействия аллергена, достигая пика интенсивности через 6-9 часов и в основном характеризуются отеком тканей, который проявляется в виде обструкции дыхательных путей.

С момента появления простых в использовании устройств для отбора проб слизистой жидкости с высокой абсорбционной способностью медиаторы, участвующие в немедленной и поздней фазах аллергических реакций, и кинетика их высвобождения за последние несколько лет стали хорошо охарактеризованы. Усилия Имперского колледжа Лондона и неопубликованные данные группы исследователей в Вене показали, что ключевые медиаторы, участвующие в непосредственной фазе, включают медиаторы тучных клеток (триптаза, PGD2), эпителиальные алармины (IL-33, sST2) и комплемент (C3a). , C4a, C5a, D-димер). Медиаторы, участвующие в реакциях поздней фазы, также включают алармины (sST2, TSLP), цитокины Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), медиаторы нейтрофилов (MMP-9) и медиаторы эозинофилов (EDN).

Однако недавно благодаря плацебо-контролируемым исследованиям стало ясно, что некоторые медиаторы действуют механически (неопубликованные наблюдения), высвобождаясь во внеклеточную среду в результате самого процесса отбора проб. Это представляет жизненно важный интерес, поскольку понимание того, какие цитокины являются механическими, а какие специфичными для аллергенов, поможет направить будущие исследования, направленные на определение конкретных биомаркеров для лечения или мониторинга заболеваний. Чтобы понять, играет ли механическое высвобождение какую-либо роль в патологической реакции на аллергены, необходимо исследовать различные когорты пациентов, чтобы увидеть, различаются ли их реакции каким-либо образом.

Рациональное исследование

В свете этого исследователи предлагают провести исследование для изучения влияния взятия образцов слизистой оболочки на высвобождение цитокинов из назального эпителия. Исследователи планируют отобрать образцы из различных групп пациентов (с аллергическим ринитом, аллергической астмой, неаллергическим), чтобы увидеть, как механические эффекты зависят от отбора проб и аллергического или неаллергического статуса. Включив 10 пациентов в каждую группу, исследователи надеются установить диапазон «нормального» механического высвобождения релевантных аллергенам цитокинов в каждой исследовательской группе, что поможет в будущих исследованиях, посвященных изучению специфических реакций на аллергены. Чтобы сопоставить как симптоматические, так и объективные ответы на пробы из дыхательных путей, будут использоваться баллы симптомов и расходомеры дыхательных путей. Чтобы составить карту кинетики ответов, участники будут проходить временной курс отбора проб слизистой оболочки в течение 8-часового периода в один день. Поскольку интервенционные вещества не вводятся, это исследование будет нести очень низкий риск для участников, проливая важный свет на эпителиальные реакции на механические манипуляции.

Дизайн исследования В этом одноцентровом пилотном исследовании на добровольной основе будут набраны в общей сложности 36 пациентов (n=12 в группе), и все они получат образцы из носа. Участники исследования пройдут забор образцов из носа за одно посещение.

Контрольный визит

Процедура:

• Подписание формы информированного согласия
• Присвоение номера проверки
• Демографические данные
• История аллергии
• Оценка критериев включения и исключения
• Тест на беременность для женщин, если требуется КПТ
• История болезни
• Пациенты, сообщающие об астме в анамнезе, должны предоставить объективные доказательства обструкции дыхательных путей и обратимости (обратимость спирометрии или метахолин/гистамин PC20 <8 мг).
• Сопутствующее лечение
• Передняя риноскопия
• Стандартный SPT с коммерческим экстрактом из: лещины, ясеня, смеси трав, амброзии, полыни, D. pteronyssinus, D. farina, перхоти кошек и собак, альтернариозов, кладоспориумов, гистамина и отрицательного контроля
• Забор крови (максимум 60 мл гепаринизированной крови и сыворотки). Часть образца крови будет отправлена ​​непосредственно в лабораторию для анализа общего IgE и специфического IgE к соответствующим аллергенам. Из остальной крови получают РНК и хранят при -80°С, а сыворотку отделяют и хранят при -20°С.
• забор проб из носа (забор слизистой кюреткой и забор носового секрета)

Пробный визит

Процедура:

• Повторная оценка In и критерии исключения (результаты аллерген-специфического IgE)
• Запись сопутствующего лечения
• Исходный образец крови
• Базовый сбор носовых образцов для обеих ноздрей (забор носового секрета) в 0 минут
• Базовый показатель TNSS
• Базовый PNIF
• Регистрация нежелательных явлений (НЯ)

• Кровь, PNIF, пробы из носа (обе ноздри: пробы слизистой кюретки и пробы назального секрета) и оценка TNSS, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 75 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин, 240 мин, 300 мин, 360 мин, 420 мин, 480 мин после начала выборки во времени

  4 Процедуры исследования

4.1 Медицинский анамнез участников, демографические данные, сопутствующее лечение Участникам будет предложено указать их медицинский анамнез, включая демографические данные и сопутствующее лечение, их аллергические симптомы, включая интенсивность и продолжительность, а также их историю лечения аллергическими препаратами.

4.2 Аллергия в анамнезе и оценка по шкале TNSS. Участникам будет предложено указать случаи чихания, ринореи, зуда в носу, заложенности носа и оценить каждый симптом. Они будут использовать следующий метод оценки симптомов: 0 = отсутствует; 1 = легкая – присутствует, но легко переносится; 2 = умеренный - присутствует, симптом беспокоит, но не мешает повседневной жизни; 3 = тяжелый - симптом трудно переносится и мешает повседневной жизни.

4.3 Передняя риноскопия Передняя риноскопия проводится один раз во время скринингового визита, чтобы исключить анатомические отклонения (например, искривление перегородки) или патологические изменения (например, носовые полипы). Это будет выполняться с использованием зеркала, когда пациент сидит, слегка запрокинув голову.

4.4 Измеритель пиковой назальной скорости вдоха (PNIF) Портативность и простота PNIF предоставляют уникальную возможность для получения объективных измерений. Он также недавно был утвержден в качестве инструмента исследования при назальной провокации аллергеном.

4.4.1 Процедура: PNIF использует трубку переменного диаметра, калиброванную непосредственно в литрах в минуту, вместе с малоинерционным индикаторным кольцом. Положение кольца после инспираторного маневра указывает на достигнутый максимальный поток. Устройство работает, когда пациент вдыхает через рот или нос, при этом воздух проходит через глюкометр, а курсор перемещается по шкале, указывая скорость вдоха. Достигнутый расход можно отметить, проверив положение курсора на калиброванной шкале.

4.4.2 PNIF в ходе исследования: участники будут обучены тому, как использовать PNIF в день исследования, а затем он будет использоваться во все временные точки исследования для получения информации о носовых выделениях.

4.5 Кожный прик-тест 4.5.1 Процедура: Аллергены вводятся в дерму предплечья путем осторожного прокола кожи через каплю (20 мкл) раствора, содержащего аллерген, стерильным ланцетом на расстоянии не менее 2 см между каждой отдельной точкой приложения. 0,9% раствор хлорида натрия будет использоваться в качестве отрицательного, а гистамин - в качестве положительного контроля. У ранее сенсибилизированных людей зудящий отек и покраснение кожи (реакция волдырей и воспалений) возникают в течение 15 минут после введения соответствующего аллергена. Через 20 минут растворы аллергенов удаляют, а края волдырей обводят шариковой ручкой. На кожу будет наклеена прозрачная лента для переноса контура волдыря на ленту для записей. Поверхность волдырей будет рассчитана с помощью цифровой планиметрии. При включении волдыри диаметром не менее 3 мм будут считаться положительной реакцией.

4.5.2 Тестовые растворы: Имеющаяся в продаже панель пыльцы деревьев и трав, сорняков и многолетних аллергенов (Allergopharma, Вена, Австрия) будет использоваться во время скринингового визита и будет храниться в соответствии с инструкциями производителя. В качестве контроля будут использоваться стерильный 0,9% раствор NaCl (отрицательный контроль) и гистамин (положительный контроль, Allergopharma, Вена, Австрия). Они будут храниться в соответствии с инструкциями производителя.

4.5.3 КПТ в ходе исследования:

Проверочный визит:

Стандартный кожный прик-тест с коммерческим экстрактом пыльцы березы и панелью пыльцы деревьев и трав, сорняков и многолетних аллергенов (все Allergopharma, Вена, Австрия), которые используются в рутинной диагностике в аллергологической клинике ЛОР-отделения, будет проводиться для оценки профиль сенсибилизации участников во время скринингового визита.

4.5.4 Меры предосторожности В качестве меры предосторожности участники будут находиться под наблюдением в течение 30 минут после тестирования. Все исследования будут проводиться в поликлинике ЛОР-отделения, где имеется полное оборудование для неотложной помощи.

4.6 Забор крови и измерение иммунологических параметров Образцы крови будут браться во время скринингового визита и во время всех визитов для исследования путем пункции локтевой вены перед кожными пробами. За одно посещение будет взято максимум 60 мл либо гепаринизированного (например, для анализа чувствительности базофилов), либо для приготовления сыворотки (например, для оценки уровней общего и аллерген-специфического иммуноглобулина или анализа RBL). Флаконы с сывороткой будут обработаны, а сыворотка будет храниться при температуре -20°C. Аллерген-специфический IgE в образцах крови во время скринингового визита будет измеряться с помощью CAP-FEIA для оценки аллерген-специфического класса RAST пациентов. Измерение общего, свободного и аллерген-специфического IgE, IgG, IgA и IgM в сыворотке будет выполняться либо с помощью CAP-FEIA, либо с помощью микрочипов, либо с помощью ELISA. Иммунные медиаторы будут измеряться с использованием платформы MSD либо нами, либо нашими сотрудниками в AstraZeneca, Кембридж, Великобритания. Измерение будет выполнено в конце исследования во всех собранных образцах сыворотки, чтобы свести к минимуму вариации между анализами.

4.7 Тестирование на беременность У участников женского пола беременность будет исключена с помощью стандартного теста мочи на беременность. Тест будет проводиться перед первым кожным прик-тестом во время скринингового визита, а затем один раз в месяц.

4.8 Сбор образцов из носа Сбор образцов из носа будет проводиться во время всех посещений. При каждом посещении образцы будут собираться с помощью назосорбции FXi/PU (содержащей синтетическую абсорбирующую матрицу (SAM)) или пластиковой кюретки длиной 10 см (назосорбционные устройства от Hunt Developments, Великобритания) (устройства Curette от Arlington Scientific, США).

4.8.1 Назосорбция с использованием FXi/PU (Hunt Developments, Великобритания). Под визуальным контролем устройство будет введено в полость носа и размещено вдоль боковой стенки к нижней носовой раковине. Указательный палец пациента будет использоваться для надавливания на внешние стороны крыльев носа и латеральных носовых хрящей, чтобы удерживать устройство на месте. Через 1 минуту устройства удаляют, а затем замораживают при температуре -80°C.

4.8.2 Забор мРНК слизистой оболочки Будет использована носовая кюретка длиной 10 см (либо Rhino-Probe, Arlington Scientific, США, либо Cellskim, Hunt Developments, Великобритания). При прямой визуализации кюретка должна располагаться напротив средней нижней части нижней носовой раковины. Кюретка прижимается к поверхности слизистой оболочки, перемещаясь кнаружи 2-3 раза. Это движение будет повторяться 2-3 раза, чтобы обеспечить хороший сбор образцов. Было показано, что эта кюретка и техника не вызывают значительного дискомфорта у участников, и поэтому они имеют то преимущество, что не требуют применения местной анестезии. После сбора клетки лизируют в буфере Qiagen RLT и хранят при температуре -80°C для последующего анализа мРНК.

5 Исследуемые продукты и исследуемый препарат 5.3 Сопутствующее лечение 5.3.1 Общие положения Все дополнительные препараты, принимаемые субъектами при включении в исследование или в любое время во время исследования, считаются сопутствующими препаратами и должны быть задокументированы в ИРК. Сопутствующие лекарства должны быть сведены к минимуму во время исследования, но при необходимости их можно назначать, если это не мешает протоколу исследования.

5.3.2 Неотложная помощь Хотя анафилактические события в этом исследовании очень маловероятны, их всегда следует считать возможными. Таким образом, в случае анафилактических реакций при КПТ немедленно будет доступен полный комплект неотложной помощи. Кроме того, если участник страдает от сильных кожных симптомов после КПТ, дезлоратадин 5 мг будет предоставлен для улучшения симптомов.

5.3.3 Запрещенное сопутствующее лечение

Субъекты не должны принимать лекарства, мешающие процедурам исследования, на протяжении всего исследования. Следующие сопутствующие методы лечения не допускаются во время этого исследования:

• Системные или местные кортикостероиды
• Другие иммунодепрессанты
• Антигистаминные препараты или динатрийкромогликат за 3 дня до визита для скрининга
• Системные или интраназальные адренергические препараты
• Психофармакологические препараты

• Ингибиторы АПФ или бета-блокаторы

  6 Нежелательные явления Нежелательным явлением является любое событие во время клинического исследования, включая интеркуррентное заболевание или несчастный случай, которое ухудшает самочувствие субъекта; он также может принимать форму аномального лабораторного значения. Термин «нежелательное явление» не подразумевает причинно-следственной связи с исследуемым лечением.

Все субъекты, испытывающие нежелательные явления, независимо от того, считаются ли они связанными с использованием исследуемого препарата или нет, будут находиться под наблюдением до тех пор, пока симптомы не исчезнут и любые аномальные лабораторные показатели не вернутся к исходному уровню, или пока не будет найдено удовлетворительное объяснение наблюдаемым изменениям, или до смерти. , и в этом случае будет предоставлен полный отчет о патологии от квалифицированного патологоанатома. Все результаты должны быть указаны на странице «Нежелательные явления» в форме записи случая.

Обо всех нежелательных явлениях будет сообщено и задокументировано, как описано ниже. Нежелательные явления делятся на категории «серьезные» и «несерьезные». Это определяет процедуру, которая должна использоваться для сообщения/документирования нежелательного явления (см. ниже).

6.1 Определение серьезных и несерьезных нежелательных явлений

Серьезным нежелательным явлением является:

• Любое событие, которое является смертельным или опасным для жизни
• Любое событие, которое навсегда отключает
• Любое событие, требующее или продлевающее госпитализацию
• Любое событие, связанное с раком, врожденной аномалией или возникающее в результате передозировки (применение дозы, превышающей установленную).

Нежелательные явления, не подпадающие под эти категории, определяются как несерьезные.

6.2 Оценка тяжести НЯ

Независимо от классификации нежелательного явления как серьезного или несерьезного (см. выше), его тяжесть должна оцениваться как легкая, умеренная или тяжелая только в соответствии с медицинскими критериями:

Легкая = не мешает рутинной деятельности, приемлемая Умеренная = мешает рутинной деятельности Тяжелая = невозможно выполнять рутинную деятельность, рассматривается врачом как неприемлемая, требует лечения, требует прекращения исследования или имеет остаточный эффект.

Следует отметить, что серьезное нежелательное явление не обязательно должно быть серьезным по своей природе. Независимо от тяжести, обо всех серьезных нежелательных явлениях необходимо сообщать, как указано ниже.

6.3 Отчетность/документирование нежелательных явлений Данные о нежелательных явлениях собираются путем спонтанных сообщений. 6.3.1 Отчетность/документирование серьезных нежелательных явлений Все серьезные нежелательные явления, возникающие во время данного исследования, независимо от того, считаются ли они связанными с исследованием или нет, должны быть задокументированы на странице «Нежелательные явления» в регистрационной форме.

Последующий отчет, включающий всю новую информацию, полученную о серьезном событии, должен быть подготовлен и собран.

Исследователь будет представлять по запросу копии всех этих отчетов в комитет по этике. При необходимости следователи информируют власти.

6.3.2 Отчетность/документирование несерьезных нежелательных явлений Они должны быть задокументированы на странице «Нежелательные явления» в регистрационной форме.

7 Статистический анализ Целью этого анализа является изучение любых статистически значимых различий в продольных траекториях назальных цитокинов между здоровыми людьми, людьми с атопией и астматиками. Сначала мы возьмемся за базовую описательную статистику. Характеристики предмета (например, состояние здоровья, демографические переменные) и переменные исхода (например, высвобождение цитокинов из носа, клинические ответы) будут описаны путем вычисления максимума, минимума, медианы, среднего значения и стандартного отклонения для метрических переменных и абсолютной и относительной частоты для категориальных переменных для каждой группы субъектов (здоровые люди, люди с атопией и астматики).

Логарифмические изменения по сравнению с исходным уровнем будут сравниваться между группами и в каждый момент времени с использованием t-тестов для каждого попарного сравнения между группами, чтобы исследовать форму траекторий во времени. Для графической иллюстрации будут нанесены индивидуальные логарифмические траектории изменения исходного уровня каждого пациента, а также групповые средние значения с 95% ДИ.

Если логарифмические изменения относительно исходного уровня демонстрируют разумную линейность, мы проверим связь между группами субъектов и продольными траекториями, используя смешанные линейные модели со случайными перехватами для конкретных субъектов, чтобы учесть внутрииндивидуальные корреляции повторных измерений, и сгруппируем по время-взаимодействие для проверки статистически значимых различий в траекториях. Мотивация этого смешанного подхода к моделированию будет заключаться в увеличении мощности за счет объединения информации в несколько моментов времени. Также будут нанесены средние траектории и 95% ДИ, полученные в результате работы по смешанному моделированию.

8 Этические и юридические аспекты Исследование будет проводиться в соответствии с требованиями местного законодательства и GCP. Он будет осуществляться в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации (1964 г.), включая текущие изменения.

8.1 Информированное согласие субъекта Прежде чем быть допущенным к участию в исследовании, субъект должен дать согласие на участие после того, как характер, объем и возможные последствия клинического исследования были объяснены в понятной ему/ей форме. Субъект должен дать согласие в письменной форме. Подпись исследователя подтвердит согласие испытуемого. Пациент может отозвать свое согласие, даже не давая замечаний, в любое время и без негативных последствий для своего дальнейшего медицинского обслуживания. Назосорбция и/или образцы РНК и/или крови могут быть отправлены в анонимной форме партнерам по сотрудничеству за пределами Австрии для анализа (например, анализ расщепленного и цельного IL-33 компанией AstraZeneca, Кембридж, Великобритания). Об этом пациент информируется в форме информированного согласия.

8.2 Подтверждение/одобрение исследования Перед началом исследования протокол исследования будет представлен в комитет по этике медицинского университета Вены и больницы общего профиля Вены (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Вена, Австрия).

8.3 Страхование Все испытуемые, участвующие в этом исследовании, будут застрахованы в страховой компании Цюриха (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Wien, тел. +43 50 1255 1255).

8.4 Конфиденциальность Имена всех субъектов будут храниться в секрете в файлах следователей. Субъекты будут идентифицированы во всей документации и оценке по номеру, присвоенному им во время исследования. Субъектам будет сообщено, что все результаты исследования будут храниться и обрабатываться в строжайшей конфиденциальности.

9 Документирование и использование результатов исследования 9.1 Документирование результатов исследования Все результаты, собранные в ходе исследования, будут собраны в файле исходных данных и позже будут перенесены в формы истории болезни (CRF). Все записи в регистрационных бланках делаются разборчиво черными или синими чернилами. В случае внесения исправлений в записи в регистрационном листе слова или цифры будут обведены и прочерчены одним штрихом. Правильное значение будет введено рядом со старой записью и датой, а исправление будет инициализировано. Неправильные записи нельзя замазывать корректирующей жидкостью, стирать или делать неразборчивыми каким-либо образом. Заполненные ИРК подписываются следователем. CRF будут заполнены сразу после итогового экзамена. Медицинские записи, на которых основана CRF, будут храниться не менее 15 лет.

9.2 Использование результатов исследования Результаты этого исследования будут опубликованы исследователями в научном журнале и представлены на научных конференциях. Перед подачей рукопись будет распространена среди всех соисследователей.

10 Соображений о потенциальных рисках и пользе для участников исследования и выборе дозы

Включенные участники не получат прямой выгоды от исследования. Однако, поскольку кинетика механической стимуляции слизистой оболочки до сих пор полностью не изучена, это всестороннее пилотное исследование даст возможность направить будущие исследования, которые, как мы надеемся, приведут к открытию новых терапевтических целей.

Потенциальные риски для участников включают боль, инфекцию и гематому в месте забора крови. При отборе проб слизистой оболочки носа и секрета возможны легкие носовые кровотечения. Во время КПТ, хотя и крайне маловероятно, возможны анафилактические реакции. Чтобы свести к минимуму риск анафилактических реакций и обеспечить оптимальное лечение в случае возникновения анафилактической реакции, пациенты будут находиться под наблюдением в течение как минимум 30 минут после КПТ. Во время всех посещений участников обученный персонал и лекарства для неотложной помощи будут доступны в любое время.