鼻细胞因子对机械刺激反应的动力学

过敏性鼻炎 (AR) 和过敏性哮喘是 I 型过敏的常见表现，I 型过敏是一种 IgE 介导的超敏反应性疾病，估计影响全球多达 40% 的人口。 IgE 由 B 细胞产生，并通过其高亲和力 Fce 受体 I (FceRI) 结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面。 表面 IgE 通过其特定的过敏原交联诱导细胞脱颗粒以及炎症介质的释放。 这个过程在几分钟内发展，导致典型的 AR 和哮喘的眼、鼻和肺症状，例如瘙痒、眼睛发红、流鼻涕和/或鼻塞以及由于下气道阻塞导致的空气滞留引起的喘息。 一些患者还可能出现晚期反应 (LPR)。 这些反应通常在过敏原暴露后 2-6 小时出现，强度在 6-9 小时之间达到峰值，并且主要以组织水肿为特征，表现为气道中的气流阻塞。

自从引入易于使用和高吸收性的粘膜液取样装置以来，在过去几年中，参与即刻和晚期过敏反应的介质及其释放动力学得到了很好的表征。 伦敦帝国理工学院的努力和维也纳研究小组未发表的数据表明，直接阶段涉及的关键介质包括肥大细胞衍生介质（类胰蛋白酶、PGD2）、上皮警报素（IL-33、sST2）和补体（C3a 、C4a、C5a、D-二聚体）。 参与晚期反应的介质还包括警报素（sST2、TSLP）、Th2 细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）、中性粒细胞介质（MMP-9）和嗜酸性粒细胞介质（EDN）。

然而，最近通过安慰剂对照研究也变得清晰的是，一些介质是机械介导的（未发表的观察结果），由于采样过程本身而被释放到细胞外环境中。 这是至关重要的，因为了解哪些细胞因子是机械性的，哪些是过敏原特异性的，将有助于指导未来的研究，这些研究试图针对特定的生物标志物进行治疗或疾病监测。 为了了解机械释放是否在对过敏原的病理反应中起任何作用，需要研究不同的患者群体，看看他们的反应是否有任何不同。

研究的合理性

鉴于此，研究人员提出了一项研究，以调查粘膜取样对鼻上皮细胞因子释放的影响。 研究人员计划对不同的患者队列（过敏性鼻炎、过敏性哮喘、非过敏性）进行采样，以了解采样和过敏或非过敏状态如何影响机械效应。 通过在每组中包括 10 名患者，研究人员希望为每个研究组中的过敏原相关细胞因子的机械释放建立一个“正常”范围，这将有助于为调查过敏原特异性反应的未来研究提供信息。 为了绘制气道采样的症状和客观反应，将使用症状评分和气道流量计。 为了绘制反应动力学图，参与者将在一天的 8 小时内接受粘膜采样时间课程。 由于没有给予任何干预性物质，这项研究对相关个体的风险非常低，同时揭示了上皮对机械操作的反应。

研究设计 在这项单中心试点研究中，将自愿招募 36 名患者（每组 n = 12 名），并将全部接受鼻腔取样。 研究参与者将在一次就诊中接受鼻腔取样。

筛选访问

程序：

• 签署知情同意书
• 放映编号分配
• 人口统计数据
• 过敏史
• 纳入和排除标准的评估
• 如果需要 SPT，则对女性进行妊娠试验
• 病史
• 报告有哮喘病史的患者必须提供气道阻塞和可逆性的客观证据（肺量计可逆性或 PC20 乙酰甲胆碱/组胺 <8mg）
• 伴随用药
• 前鼻镜检查
• 标准 SPT，含有来自以下来源的商业提取物：榛子、灰烬、混合草、豚草、艾蒿、屋尾蕨、粉尘螨、猫狗皮屑、链格孢属、枝孢属、组胺和阴性对照
• 采血（最多60毫升肝素化血液和血清）- 部分血样将直接送往实验室进行总IgE分析，以及对相关过敏原的特异性IgE分析。 从剩余的血液中，RNA 将被制备并储存在 -80°C，血清将被分离并储存在 -20°C。
• 鼻腔取样（粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）

抽样访问

程序：

• 重新评估 In 和排除标准（过敏原特异性 IgE 结果）
• 合并用药的记录
• 基线血液采样
• 0 分钟时双鼻孔的基线鼻腔标本采集（鼻分泌物采样）
• 基线 TNSS 评分
• 基线 PNI
• 不良事件 (AE) 记录

• 血液、PNIF、鼻腔取样（双鼻孔：粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）、TNSS评分，发病后15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min、180min、240min、300min、360min、420min、480min采样时程

  4 学习程序

4.1 参与者的病史、人口统计数据、合并用药 将询问参与者的病史，包括人口统计数据和合并用药、他们的过敏症状（包括强度和持续时间）以及他们的过敏用药史。

4.2 变态反应史和TNSS评分 参与者将被问及打喷嚏、流鼻涕、鼻痒、鼻塞的发生情况，并对每个症状进行分级。 他们将使用以下症状评分方法：0 = 不存在； 1 = 轻微 - 存在但容易耐受； 2 = 中度 - 存在，症状令人烦恼但不影响日常生活活动； 3 = 严重 - 症状难以忍受并且干扰日常生活活动。

4.3 前鼻镜检查 在筛选访问期间将进行一次前鼻镜检查以排除解剖学差异（例如 间隔偏差）或病理变化（例如 鼻息肉）。 它将通过使用窥器进行，患者坐着，头部略微向后。

4.4 吸气峰鼻流量计 (PNIF) PNIF 的便携性和易用性为获得客观测量值提供了独特的机会。 它最近也被验证为鼻过敏原挑战期间的研究工具。

4.4.1 程序：PNIF 使用直接以升/分钟为单位校准的可变直径管以及低惯性指示环。 吸气操作后环的位置指示达到的最大流量。 当患者通过嘴巴或鼻子吸气时，该设备就会工作，这会导致空气被吸入仪表，并且光标会沿着刻度移动以指示吸入速度。 可以通过对照校准刻度检查光标的位置来记录所达到的流速。

4.4.2 研究实施中的 PNIF：参与者将在研究当天接受如何使用 PNIF 的培训，然后将在所有研究时间点使用它来获取有关鼻腔流量的信息。

4.5 皮肤点刺试验 4.5.1 程序：通过用一滴（20 微升）含过敏原的溶液用无菌刺血针轻轻刺破皮肤，将过敏原插入前臂真皮，每个单独的应用点之间至少有 2 厘米的距离。 0.9%氯化钠溶液用作阴性对照，组胺用作阳性对照。 在以前过敏的个体中，在受到相应过敏原的攻击后 15 分钟内，会出现皮肤发痒肿胀和发红（风团和耀斑反应）。 20 分钟后，擦去过敏原溶液，并用圆珠笔描绘风团的边缘。 将透明胶带粘在皮肤上，以便将风团的轮廓转移到胶带上进行记录。 风团的表面将通过数字面积测量法计算。 对于包含物，直径至少为 3 mm 的风团将被视为阳性反应。

4.5.2 测试溶液：将在筛选访视时使用市售的树木和草花粉、杂草和多年生过敏原（Allergopharma，Vienna，Austria）组，并将根据制造商的说明进行储存。 作为对照，将使用无菌 0.9% NaCl 溶液（阴性对照）和组胺（阳性对照，Allergopharma，Vienna，Austria）。 它们将根据制造商的说明进行存储。

4.5.3 SPT 学习行为：

放映访问：

将使用商业桦树花粉提取物和一组树和草花粉、杂草和多年生过敏原（所有 Allergopharma，奥地利维也纳）进行标准皮肤点刺试验，用于耳鼻喉科过敏诊所的常规诊断，以评估筛选访问时参与者的敏感度概况。

4.5.4 安全预防措施 作为安全预防措施，将在测试后对参与者进行 30 分钟的监控。 所有检查都将在耳鼻喉科的门诊进行，那里有完整的急救设备。

4.6 血液采样和免疫学参数的测量 血液样本将在筛选访视和所有研究访视时通过在皮肤测试前肘前静脉穿刺来采集。 每次访问最多 60 毫升，或者肝素化（例如用于嗜碱性粒细胞敏感性测定）或用于制备血清（例如用于评估总免疫球蛋白和过敏原特异性免疫球蛋白水平或 RBL 测定）。 将处理血清瓶并将血清储存在-20°C。 筛选访问的血液样本的过敏原特异性 IgE 将通过 CAP-FEIA 测量，以评估患者的过敏原特异性 RAST 等级。 总的、游离的和过敏原特异性血清 IgE、IgG、IgA 和 IgM 的测量将通过 CAP-FEIA、微阵列测量或 ELISA 进行。 免疫介质将由我们或我们在英国剑桥阿斯利康的合作者使用 MSD 平台进行测量。 将在研究结束时对所有收集的血清样本进行测量，以尽量减少批间变异。

4.7 妊娠试验 在女性参与者中，将通过标准尿妊娠试验排除妊娠。 该测试将在筛选访问的第一次皮肤点刺测试之前进行，之后每月一次。

4.8 鼻腔标本采集 鼻腔标本采集将在所有访视时进行。 每次就诊都将使用鼻吸 FXi/PU（包含合成吸收基质 (SAM)）或 10 厘米长的塑料刮匙（来自英国 Hunt Developments 的鼻吸装置）（来自美国 Arlington Scientific 的刮匙装置）收集标本

4.8.1 使用 FXi/PU（Hunt Developments，英国）的鼻吸法。 在可视化下，该设备将被插入鼻腔并沿着侧壁放置在下鼻甲骨上。 患者的食指将用于按压鼻翼和侧鼻软骨的外部，以将装置固定到位。 1 分钟后，设备将被移除，然后冷冻在 -80°C。

4.8.2 粘膜 mRNA 取样 将使用 10cm 鼻刮匙（Rhino-Probe, Arlington Scientific, USA 或 Cellskim, Hunt Developments, UK）。 在直视下，刮匙将靠在下鼻甲的中下部。 将刮匙压在粘膜表面，向外移动2-3次。 此动作将重复 2-3 次以确保良好的样本采集。 这种刮匙和技术已被证明不会给参与者带来明显的不适，因此它具有不需要局部麻醉的优点。 收集后，细胞将在 Qiagen RLT 缓冲液中裂解并储存在 -80°C 下用于以后的 mRNA 分析。

5 研究产品和研究药物 5.3 伴随药物 5.3.1 概述 受试者在进入研究时或在研究期间的任何时间服用的所有额外药物均被视为伴随药物，并将记录在 CRF 中。 在研究期间应将伴随药物保持在最低限度，但如果认为有必要，在不干扰研究方案的情况下可以给予。

5.3.2 救援药物 尽管在本研究中过敏事件的可能性很小，但始终必须将其视为可能发生。 因此，如果在 SPT 发生过敏反应，将立即提供完整的应急包。此外，如果参与者在 SPT 地氯雷他定后出现严重的皮肤症状，将提供 5 毫克的地氯雷他定以改善症状。

5.3.3 禁止合并用药

在研究期间，受试者必须停止服用干扰研究程序的药物。 本研究期间不允许进行以下伴随治疗：

• 全身或局部皮质类固醇
• 其他免疫抑制剂
• 筛选访视前 3 天服用抗组胺药或色甘酸二钠
• 全身性或鼻内肾上腺素能药物
• 精神药理学药物

• ACE 抑制剂或 β 受体阻滞剂

  6 不良事件 不良事件是临床研究期间的任何事件，包括并发疾病或事故，它会损害受试者的健康；它也可能表现为异常的实验室值。 术语不良事件并不意味着与研究治疗有因果关系。

所有经历不良事件的受试者——无论是否被认为与使用研究治疗有关——都将受到监测，直到症状消退并且任何异常实验室值恢复到基线，或者直到对观察到的变化有一个令人满意的解释，或者直到死亡，在这种情况下，将提供合格病理学家的完整病理报告。 所有发现都必须在病例记录表的“不良事件”页面上报告。

将如下所述报告和记录所有不良事件。 不良事件分为“严重”和“不严重”两类。 这决定了必须用于报告/记录不良事件的程序（见下文）。

6.1 严重和非严重不良事件的定义

严重不良事件是：

• 任何致命或危及生命的事件
• 任何永久禁用的事件
• 任何需要或延长住院治疗的事件
• 任何涉及癌症、先天性异常或因过量服用（超过规定剂量的应用）而发生的事件。

不属于这些类别的不良事件被定义为不严重。

6.2 AE严重程度的评估

无论将不良事件分类为严重或非严重（见上文），其严重程度必须仅根据医学标准评估为轻度、中度或重度：

轻度 = 不干扰日常活动，可接受 中度 = 干扰日常活动 重度 = 无法进行日常活动，被医生认为是不可接受的，需要治疗，需要停止研究，或有残余影响。

应该注意的是，严重的不良事件不一定是严重的。 无论严重程度如何，所有严重不良事件都必须按以下方式报告。

6.3 不良事件的报告/记录不良事件通过自发报告收集。 6.3.1 严重不良事件的报告/记录 本研究期间发生的所有严重不良事件，无论是否被认为与研究相关，都必须记录在病例记录表的“不良事件”页面上。

必须准备并收集一份后续报告，其中包括获得的有关严重事件的所有新信息。

调查员将根据要求向伦理委员会提交所有这些报告的副本。 必要时，调查人员会通知当局。

6.3.2 非严重不良事件的报告/记录 这些将记录在病例记录表的“不良事件”页面上。

7 统计分析 这些分析将寻求探索健康个体、特应性个体和哮喘患者之间纵向鼻细胞因子轨迹的任何统计学显着差异。 我们将首先进行基本的描述性统计。 主题特征（例如 健康状况、人口统计变量）和结果变量（例如 鼻细胞因子释放、临床反应）将通过计算每个受试者组（健康个体、特应性个体和哮喘患者）的度量变量的最大值、最小值、中值、平均值和标准偏差以及分类变量的绝对和相对频率来描述。

将在各组之间比较基线的日志变化，并在每个时间点使用 t 检验对各组之间的每个成对比较进行比较，以探索随时间推移的轨迹形状。 对于图形说明，将绘制每个患者的个体对数基线变化轨迹以及具有 95% CI 的组均值。

如果日志从基线变化显示出合理的线性，我们将使用混合线性模型和特定于受试者的随机截距来测试受试者组和纵向轨迹之间的关联，以解释重复测量的个体内相关性，并分组时间交互项来测试轨迹的统计显着差异。 这种混合建模方法的动机是通过跨多个时间点组合信息来增加能力。还将绘制混合建模工作推断的平均轨迹和 95% CI

8 伦理和法律方面 本研究将按照当地法律要求和 GCP 进行。 它将根据赫尔辛基宣言（1964 年）的指导方针进行，包括当前的修订。

8.1 受试者的知情同意 在被纳入研究之前，受试者必须在以他/她可以理解的形式解释临床研究的性质、范围和可能的后果后同意参与。 受试者必须书面同意。 研究者的签名将确认受试者的同意。 患者可以随时撤回同意，即使没有发表评论，也不会对他未来的医疗造成负面影响。 鼻吸和/或 RNA 和/或血液样本可以匿名形式发送给奥地利以外的合作伙伴进行分析（例如 AstraZeneca, Cambridge UK 对切割的和完整的 IL-33 的分析）。 患者在知情同意书中被告知这一点。

8.2 研究的确认/批准 在研究开始之前，研究方案将提交给维也纳医科大学伦理委员会和维也纳总医院（Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Vienna, Austria）。

8.3 保险 所有参与本研究的受试者都将在苏黎世保险公司投保（Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienna, Tel. +43 50 1255 1255）。

8.4 保密 所有受试者的姓名将在研究者档案中保密。 受试者将在整个记录和评估过程中根据研究期间分配给他们的编号来识别。 受试者将被告知所有研究结果都将以最严格的保密方式存储和处理。

9 研究结果的记录和使用 9.1 研究结果的记录 研究期间收集的所有结果将收集在源数据文件中，随后将转移到病例报告表 (CRF) 中。 病例记录表上的所有条目都将用黑色或蓝色墨水清楚地书写。 如果对案例记录表中的条目进行了更正，文字或数字将被圈起来，并在其中画出一个笔划。 将在旧条目和日期旁边输入正确的值，并在更正处加上草签。 不正确的条目不得用涂改液覆盖或以任何方式涂掉或使其难以辨认。 完成的 CRF 将由研究者签名。 CRF 将在期末考试后立即完成。 CRF 所依据的医疗记录将至少保存 15 年。

9.2 研究结果的使用 本研究的结果将由研究人员在科学期刊上发表，并在科学会议上发表。 手稿将在提交前分发给所有合作研究者。

10 对研究参与者的潜在风险和益处以及剂量选择的考虑

纳入的参与者不会直接从研究中受益。 然而，由于机械粘膜刺激的动力学仍未完全了解，这项全面的初步研究将为指导未来的研究提供机会，这将有望导致发现新的治疗靶点。

参与者的潜在风险包括抽血部位的疼痛、感染和血肿。 在鼻粘膜和分泌物取样过程中，可能存在轻度鼻出血的风险。 在 SPT 期间，虽然极不可能发生过敏反应，但有可能发生。 为了最大限度地降低过敏反应的风险并在发生过敏反应的情况下提供最佳治疗，将在 SPT 后至少监测患者 30 分钟。 在所有参与者访问中，训练有素的人员和紧急药物将始终可用。