Cinética das respostas de citocinas nasais à estimulação mecânica

A rinite alérgica (RA) e a asma alérgica são manifestações comuns da alergia tipo I, uma doença de hipersensibilidade mediada por IgE que afeta até 40% da população global. A IgE é produzida por células B e se liga à superfície de mastócitos e basófilos por meio de seu receptor Fce I de alta afinidade (FceRI). A reticulação da IgE de superfície por seu alérgeno específico induz a degranulação das células, bem como a liberação de mediadores inflamatórios. Este processo que se desenvolve ao longo de minutos leva aos sintomas oculares, nasais e pulmonares típicos de AR e asma, como coceira, vermelhidão dos olhos, coriza e/ou congestão nasal e respiração ofegante devido ao aprisionamento de ar como resultado da obstrução das vias aéreas inferiores. Alguns pacientes também podem desenvolver reações de fase tardia (LPR). Essas respostas geralmente se desenvolvem 2 a 6 horas após a exposição ao alérgeno, com pico de intensidade entre 6 a 9 horas e são caracterizadas principalmente por edema tecidual que se manifesta como obstrução do fluxo de ar nas vias aéreas.

Desde a introdução de dispositivos de amostragem de fluido mucoso fáceis de usar e altamente absorventes, os mediadores envolvidos nas respostas alérgicas de fase imediata e tardia e a cinética de sua liberação tornaram-se bem caracterizados nos últimos anos. Esforços do Imperial College London e dados inéditos do grupo de pesquisadores em Viena mostraram que os principais mediadores envolvidos na fase imediata incluem mediadores derivados de mastócitos (triptase, PGD2), alarminas epiteliais (IL-33, sST2) e complemento (C3a , C4a, C5a, D-dímero). Os mediadores envolvidos nas reações de fase tardia também incluem alarminas (sST2, TSLP), citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), mediadores neutrófilos (MMP-9) e mediadores eosinófilos (EDN).

No entanto, o que também ficou claro recentemente por meio de estudos controlados por placebo é que alguns mediadores são mediados mecanicamente (observações não publicadas), sendo liberados no ambiente extracelular como resultado do próprio processo de amostragem. Isso é de interesse vital, pois entender quais citocinas são mecânicas e quais são específicas para alérgenos ajudará a orientar estudos futuros que tentem direcionar biomarcadores específicos para tratamento ou monitoramento de doenças. Para entender se a liberação mecânica desempenha algum papel na resposta patológica a alérgenos, diferentes grupos de pacientes precisarão ser investigados para ver se suas respostas diferem de alguma forma.

Racional do Estudo

Diante disso, os pesquisadores propõem um estudo para investigar os efeitos da amostragem da mucosa na liberação de citocinas do epitélio nasal. Os investigadores planejam amostrar diferentes coortes de pacientes (rinite alérgica, asma alérgica, não alérgica) para ver como os efeitos mecânicos são influenciados pela amostragem e pelo estado alérgico ou não alérgico. Ao incluir 10 pacientes em cada grupo, os investigadores esperam estabelecer uma faixa de "normal" para liberação mecânica de citocinas relevantes para alérgenos em cada grupo de estudo, o que ajudará a informar futuros estudos que investigam respostas específicas a alérgenos. Para mapear as respostas sintomáticas e objetivas à amostragem das vias aéreas, serão empregados escores de sintomas e medidores de fluxo das vias aéreas. Para mapear a cinética das respostas, os participantes passarão por um período de tempo de amostragem da mucosa ao longo de um período de 8 horas em um único dia. Como nenhuma substância intervencionista está sendo administrada, este estudo terá um risco muito baixo para os indivíduos envolvidos, ao mesmo tempo em que lança uma luz importante sobre as respostas epiteliais à manipulação mecânica.

Desenho do estudo Neste estudo piloto de centro único, um total de 36 pacientes (n=12 por grupo) será recrutado voluntariamente e todos receberão amostras nasais. Os participantes do estudo serão submetidos à amostragem nasal em uma única visita.

Visita de Triagem

Procedimento:

• Assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
• Atribuição do número de triagem
• Dados demográficos
• Histórico de alergia
• Avaliação dos critérios de inclusão e exclusão
• Teste de gravidez para mulheres se precisar de SPT
• Histórico médico
• Os pacientes que relatam história de asma terão que fornecer evidências objetivas de obstrução e reversibilidade das vias aéreas (reversibilidade espirométrica ou PC20 metacolina/histamina <8mg)
• Medicação concomitante
• rinoscopia anterior
• SPT padrão com extrato comercial de: avelã, freixo, mistura de ervas, ambrósia, artemísia, D. pteronyssinus, D. farina, pelos de gato e cachorro, alternaria, cladosporium, histamina e controle negativo
• Amostragem de sangue (max 60ml de sangue heparinizado e soro) - Uma parte da amostra de sangue será enviada diretamente ao laboratório para análise de IgE total e IgE específica para alérgenos relevantes. Do restante do sangue, o RNA será preparado e armazenado a -80°C e o soro será separado e armazenado a -20°C.
• amostragem nasal (amostragem de cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)

Visita de Amostragem

Procedimento:

• Reavaliação dos Critérios de Inclusão e Exclusão (resultados de IgE específicos para alérgenos)
• Registro de medicação concomitante
• Amostragem de sangue de linha de base
• Coleta de amostras nasais de linha de base para ambas as narinas (amostragem de secreção nasal) em 0min
• Pontuação TNSS basal
• PNIF basal
• Registro de evento adverso (EA)

• Sangue, PNIF, amostragem nasal (ambas as narinas: amostragem de cureta mucosa e amostragem de secreção nasal) e escore TNSS, 15min, 30min, 45min, 60min, 75min, 90min, 120min, 180min, 240min, 300min, 360min, 420min, 480min após o início de tempo de amostragem

  4 Procedimentos de estudo

4.1 Histórico médico dos participantes, dados demográficos, medicação concomitante Os participantes serão questionados sobre seu histórico médico, incluindo dados demográficos e medicação concomitante, seus sintomas alérgicos, incluindo intensidade e duração, e seu histórico de medicação alérgica.

4.2 Histórico de alergia e escore TNSS Os participantes serão questionados sobre a ocorrência de espirros, rinorreia, prurido nasal, congestão nasal e a classificação de cada sintoma. Eles usarão o seguinte método de pontuação de sintomas: 0 = ausente; 1 = leve - presente, mas facilmente tolerado; 2 = moderado - presente, o sintoma incomoda, mas não interfere nas atividades de vida diária; 3 = grave - o sintoma é difícil de tolerar e está interferindo nas atividades da vida diária.

4.3 Rinoscopia anterior A rinoscopia anterior será realizada uma vez durante a visita de triagem para excluir variações anatômicas (por exemplo, desvio septal) ou alterações patológicas (ex. pólipos nasais). Será realizada com o uso de espéculo com o paciente sentado com a cabeça ligeiramente para trás.

4.4 Medidor de pico de fluxo nasal inspiratório (PNIF) A portabilidade e facilidade do PNIF oferece uma oportunidade única para obter medições objetivas. Também foi recentemente validado como uma ferramenta de estudo durante o desafio nasal com alérgenos.

4.4.1 Procedimento: O PNIF utiliza um tubo de diâmetro variável calibrado diretamente em litros por minuto juntamente com um anel indicador de baixa inércia. A posição do anel após uma manobra inspiratória indica o fluxo máximo alcançado. O dispositivo funciona quando um paciente inala pela boca ou nariz, isso faz com que o ar seja aspirado pelo medidor e um cursor se mova ao longo da escala para indicar a velocidade da inalação. A taxa de fluxo alcançada pode ser observada verificando a posição do cursor em relação à escala calibrada.

4.4.2 PNIF na condução do estudo: Os participantes serão treinados sobre como usar o PNIF no dia do estudo e, em seguida, ele será usado em todos os momentos do estudo para obter informações sobre o fluxo nasal.

4.5 Teste cutâneo em picada 4.5.1 Procedimento: Os alérgenos são inseridos na derme do antebraço, picando suavemente a pele através de uma gota (20ul) de uma solução contendo alérgenos com uma lanceta estéril com pelo menos 2 cm entre cada ponto de aplicação individual. Solução de cloreto de sódio a 0,9% será utilizada como controle negativo e histamina como controle positivo. Em indivíduos previamente sensibilizados, ocorrerá inchaço pruriginoso e vermelhidão da pele (pápula e reação eruptiva) dentro de 15 minutos após o desafio com o respectivo alérgeno. Após 20 minutos, as soluções de alérgenos serão removidas e as margens das pápulas serão traçadas com uma caneta esferográfica. Fita transparente será colada na pele a fim de transferir o contorno da pápula para a fita para os registros. A superfície das pápulas será calculada por planimetria digital. Para inclusão, pápulas de pelo menos 3 mm de diâmetro serão consideradas reações positivas.

4.5.2 Soluções de teste: Um painel disponível comercialmente de pólen de árvores e gramíneas, ervas daninhas e alérgenos perenes (Allergopharma, Viena, Áustria) será usado na visita de triagem e será armazenado de acordo com as instruções do fabricante. Como controles, serão utilizadas solução estéril de NaCl 0,9% (controle negativo) e histamina (controle positivo, Allergopharma, Viena, Áustria). Eles serão armazenados de acordo com as instruções do fabricante.

4.5.3 SPT na condução do estudo:

Visita de Triagem:

Um teste cutâneo padrão com extrato de pólen de bétula comercial e um painel de pólen de árvores e gramíneas, ervas daninhas e alérgenos perenes (todos Allergopharma, Viena, Áustria), conforme usado no diagnóstico de rotina na clínica de alergia do departamento de otorrinolaringologia, será realizado para avaliar a perfil de sensibilização dos participantes na visita de triagem.

4.5.4 Precauções de segurança Como medida de precaução, os participantes serão monitorados por 30 minutos após o teste. Todas as investigações serão feitas no Ambulatório do Departamento de Otorrinolaringologia, onde está disponível todo o equipamento de emergência.

4.6 Amostragem de sangue e medição dos parâmetros imunológicos Amostras de sangue serão coletadas na visita de triagem e em todas as visitas do estudo por punção da veia antecubital antes do teste cutâneo. Um máximo de 60 ml por visita será tomado heparinizado (por exemplo, para ensaios de sensibilidade a basófilos) ou para a preparação de soro (por exemplo, para avaliação dos níveis de imunoglobulina total e específica do alergênio ou ensaio de RBL). Os frascos de soro serão processados ​​e o soro armazenado a -20°C. A IgE específica do alérgeno das amostras de sangue da visita de triagem será medida por CAP-FEIA para avaliar a classe RAST específica do alérgeno dos pacientes. A medição de IgE, IgG, IgA e IgM sérica total, livre e específica para alérgenos será realizada por CAP-FEIA, por medição de microarray ou ELISA. Os mediadores imunológicos serão medidos usando a plataforma MSD por nós ou por nossos colaboradores da AstraZeneca, Cambridge, Reino Unido. A medição será realizada no final do estudo em todas as amostras de soro coletadas para minimizar a variação interensaio.

4.7 Teste de gravidez Em participantes do sexo feminino, a gravidez será excluída com um teste de gravidez de urina padrão. O teste será realizado antes do primeiro teste cutâneo por picada na visita de triagem e depois uma vez por mês.

4.8 Coleta de amostra nasal A coleta de amostra nasal será realizada em todas as visitas. Para cada visita, as amostras serão coletadas usando FXi/PU de nasossorção (contendo uma matriz absortiva sintética (SAM)) ou uma cureta plástica de 10 cm de comprimento (dispositivos de nasossorção da Hunt Developments, Reino Unido) (dispositivos Curette da Arlington Scientific, EUA)

4.8.1 Nasoadsorção usando FXi/PU (Hunt Developments, Reino Unido). Sob visualização, o dispositivo será inserido na cavidade nasal e colocado ao longo da parede lateral contra o corneto inferior. O dedo indicador do paciente será usado para pressionar os aspectos externos das cartilagens nasais alares e laterais para manter o dispositivo no lugar. Após 1 minuto, os dispositivos serão removidos e congelados a -80°C.

4.8.2 Amostragem de mRNA da mucosa Será utilizada uma cureta nasal de 10 cm (Rhino-Probe, Arlington Scientific, EUA ou Cellskim, Hunt Developments, Reino Unido). Sob visualização direta, a cureta será posicionada contra a porção médio-inferior do corneto inferior. A cureta será pressionada contra a superfície mucosa movida para fora 2-3 vezes. Este movimento será repetido 2-3 vezes para garantir uma boa coleta de amostra. Esta cureta e técnica demonstraram não causar desconforto significativo aos participantes e, portanto, tem a vantagem de não exigir anestesia local. Após a coleta, as células serão lisadas em tampão Qiagen RLT e armazenadas a -80°C para posterior análise de mRNA.

5 Produtos sob investigação e medicação do estudo 5.3 Medicação concomitante 5.3.1 Geral Todos os medicamentos adicionais tomados pelos participantes no início do estudo ou a qualquer momento durante o estudo são considerados medicamentos concomitantes e serão documentados no CRF. Os medicamentos concomitantes devem ser reduzidos ao mínimo durante o estudo, mas, se considerados necessários, podem ser administrados se não interferirem no protocolo do estudo.

5.3.2 Medicação de resgate Embora os eventos anafiláticos sejam muito improváveis ​​neste estudo, eles sempre devem ser considerados possíveis. Portanto, um kit de emergência completo estará disponível imediatamente em caso de reações anafiláticas no SPT. Além disso, se o participante estiver sofrendo de sintomas de pele fortes após o SPT, desloratadina 5mg será fornecida para melhorar os sintomas.

5.3.3 Medicação concomitante proibida

Os indivíduos devem permanecer sem medicamentos que interfiram nos procedimentos do estudo durante o estudo. Os seguintes tratamentos concomitantes não são permitidos durante este estudo:

• Corticosteroides sistêmicos ou tópicos
• Outros medicamentos imunossupressores
• Anti-histamínicos ou cromoglicato dissódico 3 dias antes da consulta de triagem
• Drogas adrenérgicas sistêmicas ou intranasais
• Drogas psicofarmacológicas

• Inibidores da ECA ou betabloqueadores

  6 Eventos adversos Um evento adverso é qualquer evento durante um estudo clínico, incluindo doença intercorrente ou acidente, que prejudique o bem-estar do sujeito; também pode assumir a forma de um valor laboratorial anormal. O termo evento adverso não implica uma relação causal com o tratamento do estudo.

Todos os indivíduos que apresentarem eventos adversos - considerados ou não associados ao uso do tratamento do estudo - serão monitorados até que os sintomas desapareçam e qualquer valor laboratorial anormal tenha retornado à linha de base, ou até que haja uma explicação satisfatória para as alterações observadas, ou até a morte , caso em que será fornecido um relatório patológico completo de um patologista qualificado. Todos os achados devem ser relatados em uma página de "evento adverso" no formulário de registro do caso.

Todos os eventos adversos serão relatados e documentados conforme descrito abaixo. Os eventos adversos são divididos nas categorias "graves" e "não graves". Isso determina o procedimento que deve ser usado para relatar/documentar o evento adverso (veja abaixo).

6.1 Definição de eventos adversos graves e não graves

Um evento adverso grave é:

• Qualquer evento fatal ou com risco de vida
• Qualquer evento que esteja desativando permanentemente
• Qualquer evento que requeira ou prolongue a hospitalização
• Qualquer evento que envolva câncer, anomalia congênita ou ocorra como resultado de superdosagem (aplicação de mais do que a dose estipulada).

Os eventos adversos que não se enquadram nessas categorias são definidos como não graves.

6.2 Avaliação da gravidade do EA

Independentemente da classificação de um evento adverso como grave ou não grave (ver acima), sua gravidade deve ser avaliada como leve, moderada ou grave, de acordo apenas com critérios médicos:

Leve = não interfere nas atividades rotineiras, aceitável Moderado = interfere nas atividades rotineiras Grave = impossibilidade de realizar atividades rotineiras, considerado inaceitável pelo médico, requer tratamento, requer interrupção do estudo ou tem efeito residual.

Deve-se notar que um evento adverso grave não precisa ser de natureza grave. Independentemente da gravidade, todos os eventos adversos graves devem ser relatados conforme abaixo.

6.3 Notificação/documentação de eventos adversos Os eventos adversos são coletados por notificação espontânea. 6.3.1 Notificação/documentação de eventos adversos graves Todos os eventos adversos graves ocorridos durante este estudo, considerados ou não associados ao estudo, devem ser documentados na página "Evento adverso" no formulário de registro de caso.

Um relatório de acompanhamento incluindo todas as novas informações obtidas sobre o evento grave deve ser preparado e será coletado.

O investigador enviará, mediante solicitação, cópias de todos esses relatórios ao comitê de ética. Sempre que necessário, os investigadores informarão as autoridades.

6.3.2 Notificação/documentação de eventos adversos não graves Devem ser documentados na página "Evento adverso" no formulário de registro do caso.

7 Análise estatística Estas análises procurarão explorar quaisquer diferenças estatisticamente significativas nas trajetórias longitudinais das citocinas nasais entre indivíduos saudáveis, indivíduos atópicos e asmáticos. Vamos primeiro realizar estatísticas descritivas básicas. Características do sujeito (por exemplo, estado de saúde, variáveis ​​demográficas) e variáveis ​​de resultado (por exemplo, liberação nasal de citocinas, respostas clínicas) serão descritos calculando máximo, mínimo, mediana, média e desvio padrão para variáveis ​​métricas e frequências absolutas e relativas para variáveis ​​categóricas para cada grupo de sujeitos (indivíduos saudáveis, indivíduos atópicos e asmáticos).

As alterações de log da linha de base serão comparadas entre os grupos e em cada ponto de tempo usando testes t para cada comparação pareada entre os grupos, para explorar a forma das trajetórias ao longo do tempo. Para ilustração gráfica, as trajetórias individuais de alteração da linha de base de cada paciente serão plotadas, bem como as médias do grupo com ICs de 95%.

Se as alterações logarítmicas em relação à linha de base exibirem linearidade razoável, testaremos uma associação entre grupos de sujeitos e trajetórias longitudinais usando modelos lineares mistos com interceptações aleatórias específicas do sujeito para contabilizar correlações intra-individuais de medidas repetidas e agrupar por termos de interação de tempo para testar diferenças estatisticamente significativas em trajetórias. A motivação dessa abordagem de modelagem mista será aumentar o poder combinando informações em vários pontos no tempo. Trajetórias médias e ICs de 95%, conforme inferido pelo trabalho de modelagem mista, também serão plotados

8 Aspectos éticos e legais O estudo será realizado de acordo com os requisitos legais locais e BPC. Será realizado de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque (1964), incluindo as revisões atuais.

8.1 Consentimento informado do sujeito Antes de ser admitido no estudo, o sujeito deve ter consentido em participar após a natureza, escopo e possíveis consequências do estudo clínico terem sido explicados de forma compreensível para ele/ela. O sujeito deve dar consentimento por escrito. A assinatura do investigador confirmará o consentimento do sujeito. O paciente pode retirar o consentimento, mesmo sem fazer comentários, a qualquer momento e sem consequências negativas para os seus cuidados médicos futuros. A nasoabsorção e/ou RNA e/ou amostras de sangue podem ser enviadas de forma anônima para parceiros de colaboração fora da Áustria para análise (por exemplo, análise de IL-33 clivada e inteira pela AstraZeneca, Cambridge UK). O paciente é informado sobre isso no formulário de consentimento informado.

8.2 Reconhecimento/aprovação do estudo Antes do início do estudo, o protocolo do estudo será submetido ao comitê de ética da universidade médica de Viena e do hospital geral de Viena (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Viena, Áustria).

8.3 Seguro Todos os participantes deste estudo serão segurados na Zürich Insurance Company (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienna, Tel. +43 50 1255 1255).

8.4 Confidencialidade Os nomes de todos os sujeitos serão mantidos em segredo nos arquivos dos investigadores. Os indivíduos serão identificados ao longo da documentação e avaliação pelo número atribuído a eles durante o estudo. Os participantes serão informados de que todos os resultados do estudo serão armazenados e tratados com a maior confidencialidade.

9 Documentação e uso dos resultados do estudo 9.1 Documentação dos resultados do estudo Todos os resultados coletados durante o estudo serão coletados em um arquivo de dados de origem e posteriormente transferidos para os formulários de relato de caso (CRFs). Todas as entradas nos formulários de registro de caso serão feitas de forma legível em tinta preta ou azul. Se forem feitas correções nas entradas do formulário de registro do caso, as palavras ou números serão marcados e um único traço será traçado entre eles. O valor correto será inserido ao lado da entrada e data antigas e a correção será rubricada. Entradas incorretas não devem ser cobertas com fluido corretivo ou obliteradas ou ilegíveis de qualquer forma. Os CRFs preenchidos serão assinados pelo investigador. Os CRFs serão preenchidos imediatamente após o exame final. Os registros médicos nos quais o CRF se baseia serão mantidos por pelo menos 15 anos.

9.2 Uso dos resultados do estudo Os resultados deste estudo serão publicados pelos investigadores em uma revista científica e apresentados em reuniões científicas. O manuscrito será distribuído a todos os co-investigadores antes da submissão.

10 Considerações sobre riscos e benefícios potenciais para os participantes do estudo e seleção da dose

Os participantes incluídos não se beneficiarão diretamente do estudo. No entanto, como a cinética da estimulação mecânica da mucosa ainda não é completamente compreendida, este estudo piloto abrangente fornecerá uma oportunidade para orientar pesquisas futuras que, com sorte, levarão à descoberta de novos alvos terapêuticos.

Os riscos potenciais para os participantes incluem dor, infecção e hematoma no local da coleta de sangue. Durante a coleta de mucosa nasal e secreção, sangramento nasal leve é ​​um risco possível. Durante o SPT, embora altamente improvável, as reações anafiláticas são uma possibilidade. Para minimizar o risco de reações anafiláticas e fornecer tratamento ideal caso ocorra uma reação anafilática, os pacientes serão monitorados por no mínimo 30 minutos após o SPT. Em todas as visitas dos participantes, pessoal treinado e medicamentos de emergência estarão disponíveis o tempo todo.