X-kromoszóma inaktiválás, epigenetika és transzkriptom

Az X-kromoszóma számos szindróma patogenezisének alapköve, amelyek közül néhány a Turner-szindróma (45,X), a Klinefelter-szindróma (47,XXY), a hármas X-szindróma (47,XXX) és a kettős Y-szindróma (47,XYY) ). Annak ellenére, hogy ez fontos a klinikai betegségek szempontjából, az X-kromoszómán eddig csak egy gén vett részt az ezekben és más X-hez kapcsolódó szindrómákban megfigyelhető fenotípusos tulajdonságok széles spektrumában. Az egyik ismert gén a SHOX (az alacsony termetű homeobox) gén, és egy transzkripciós faktort kódol, amelynek transzkripciós célpontja az agy natriuretikus peptidje (BNP) és a fibroblaszt növekedési faktor receptor génje (FGFR3). Az X és Y kromoszómák pszeudoautoszomális régiójában található. Kimutatták, hogy ez a gén szerepet játszik az alacsony termetben Turner-szindrómában, Leri-Weill-szindrómában és idiopátiás alacsony termetben. Klinefelter-szindrómában, hármas X-szindrómában és XYY-szindrómában is megnövekedett termetet okoz.

Az X-kromoszómális szindrómákban számos olyan tulajdonság és betegség fordul elő, amelyek nem magyarázhatók ezzel a SHOX-génnel. E szindrómák közül a legjobban a Turner-szindróma jellemzi, ahol ezek a fenotípus-vonások a következőkre oszthatók:

1. Autoimmun hajlam, amely gyakorlatilag az összes ismeretlen eredetű autoimmun betegség, mint például a cukorbetegség és a pajzsmirigy alulműködés kockázatának növekedéséhez vezet.
2. Csökkent intrauterin életképesség. Itt a méhlepényben működő, X-hez kötött pszeudoautoszomális gének haploinsufficienciája is szerepet játszik (STS és CSF2RA).
3. Petefészek-dysgenesis, ami petefészek-elégtelenséghez és hosszú távú nemi hormonpótló terápia szükségességéhez vezet.
4. Megoldatlan patogenezisek veleszületett kardiovaszkuláris rendellenességei.
5. Az agy fejlődése, különösen a szociális-kognitív fejlődés, amely sok esetben módosul, gyakran "férfiszerűbb" irányba.
6. A metabolikus szindróma és a csontritkulás megnövekedett gyakorisága. Egészséges női sejtekben, két X-kromoszómával, véletlenszerű X-inaktiváció megy végbe (13). A folyamatot az X inaktivációs központ (XIC) irányítja, és a Xist kezdeményezi, amely egy hosszú beavatkozó, nem kódoló RNS-t (lincRNS) kódoló gén. A Xist gén az X kromoszóma hosszú karján a centromer közelében található, ahonnan inaktiválódáshoz vezető represszív hisztonmódosításokat (PRC2 toborzást) szervez az X kromoszóma mentén. A fennmaradó aktív X-kromoszómában a PRC2-t a Tsix titrálja, ami gyakorlatilag minden nőstény mozaikként hagyja el az X kromoszómát, az egyik anyai és egy apai eredetű. Az X-kromoszómán elterjedt gének nagy része azonban ismeretlen mechanizmusok révén elkerüli ezt az X-inaktivációt, és dóziskompenzáció történik, így a hímek és nők közötti expresszió sok gén esetében összehasonlítható (15, 16). A gének megközelítőleg 65%-a teljesen elnémult, míg 15%-uk teljesen elkerüli az X-inaktivációt, 20%-uk pedig változó expressziót mutat a szöveti sejt eredetétől függően (17).

A LincRNS-ek mindenütt átíródnak a genomban, bár az egészségben és a betegségekben betöltött szerepük kevéssé ismert. A dóziskompenzáció, az imprinting és a homeotikus génexpresszió tanulmányozása azt sugallja, hogy a lincRNS-ek a DNS és a kromatin átalakulása közötti határfelületen működnek, és további szerepet játszanak a kromatin újraprogramozásában, hogy elősegítsék a rák metasztázisát. A mai napig egy sor különféle kölcsönhatást feltételeztek a lincRNS-ekre a transzkripciós szabályozásban, és ezek egyaránt működhetnek intakt kölcsönhatásba lépő molekulákként, valamint Dicer által feldolgozott molekulákként, amelyeket apró, zavaró RNS-ekre vágnak, amelyek lebontják a többi RNS-t.

A kromatin átépülését a hisztonok által a DNS-szálon hagyott nyomok alapján elemezhetjük, amelyek a hisztonok acetilezésétől vagy metilációjától függően lehetnek permisszív vagy represszív jellegűek. Például a lizin 4 trimetilációja a H3 hisztonon (H3K4me3) a transzkripciósan aktív génpromotereknél gazdagodik, míg a H3K9 (H3Kme3) és H3K27 (H3K27me3) trimetilációja a transzkripciósan elnyomott génpromotereknél van jelen. A kromatin immunprecipitáció és a mély szekvenálás (chIPseq) használatával egyetlen vizsgálatban megkaphatjuk ezeket a jeleket a teljes X-kromoszóma mentén.

A hiszton módosulatok epigenetikai változásait új módszertannal lehet vizsgálni, amely lehetővé teszi viszonylag régi patológiás minták felhasználását. Ez új távlatokat nyit az X-kromoszóma engedélyezésének és inaktiválásának szerepével kapcsolatos ismereteink bővítésére a különböző betegségekben, ahol az X-kromoszómális szindrómák kiindulási modellként szolgálhatnak olyan folyamatok megértéséhez, amelyek nagy valószínűséggel fontosak a betegségek szempontjából (pl. cukorbetegség és hypothyreosis) ezeken a szindrómákon túl. Egy másik példa, hogy a szív veleszületett fejlődési rendellenességei gyakoriak Turner-szindrómában, és gyakran korai aortatáguláshoz és disszekcióhoz vezetnek. Ezeknél a betegeknél és a kontrolloknál paraffinba ágyazott szövetblokkokat gyűjtünk az aorta falából, amelyek most már értékelhetők ezzel a frontvonalbeli módszerrel, és új nyomokat azonosíthatnak a Turner-betegek DNS-én, összehasonlítva a nem Turner-betegek DNS-ével.

Az imprinting egy másik fontos szempont a nemi kromoszóma működésében. Az imprinting arra a folyamatra utal, amelyben egy gén (vagy több gén) benyomódhat a szülői származástól függően. Másképpen fogalmazva, egy gén „be- vagy kikapcsolható” attól függően, hogy apai származású. Ezenkívül az egerekkel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy az X kromoszómán lévő géncsoportok lenyomatozódnak, és függetlenek az X kromoszóma inaktivációjától.

A biológiai öröklődés jelentősége nyilvánvaló a populációt érintő jelentősebb kardiovaszkuláris megbetegedések esetében, ahol bizonyos családokban egyértelműen érvényesül az örökletes tulajdonság. A szív- és érrendszeri megbetegedések megelőzését és kezelését célzó ígéret ellenére a genom azon specifikus részei, amelyek potenciálisan kiválthatják a patológiákat, nagyrészt meghatározásra várnak, és fontos ismereteket hozhatnak a patofiziológiáról.

A genom-rendellenességek következményeivel kapcsolatos ismeretek jelentős része nyilvánvaló és súlyos megnyilvánulásokkal járó betegségekből származik, amelyek egyértelmű átviteli módokból erednek, amelyek lehetővé teszik a genom okozó régióinak azonosítását. Az ilyen genetikai rendellenességek lehetőséget adnak a genom egy specifikus lokuszának szerepének megértésére, ha ez azonosítható, mivel gyakran nagy kromoszómarégiókról van szó. Az X-kromoszómális fenotípusok esetében azt várjuk, hogy a kórokozó az X kromoszómán legyen, és ennek azonosítására különféle új technológiákat alkalmazunk.

Jelenleg korlátozott ismereteink az X-kromoszóma kardiovaszkuláris patológiában betöltött szerepéről az egygénes rendellenességekből és a nemi kromoszóma anomáliákon túlmenően a nem specifikus nemi különbségekből erednek. Ezzel szemben az Y-kromoszómán egyetlen génből álló rendellenességet sem állapítottak meg, amely összefüggésben lenne a kardiovaszkuláris morbiditással.

Megfelelő humán modellek állnak rendelkezésre a nemi kromoszómák szerepének jobb megértéséhez. Itt a normalitástól való eltérések nemcsak ésszerű gyakorisággal fordulnak elő, hanem könnyen azonosítható fenotípusokkal és kedvezőtlen prognózissal is társulnak. Ilyen modellek a Turner- és Klinefelter-szindrómák; a nőstények az X-kromoszómaanyag csökkenésével, a férfiak pedig az X-kromoszómaanyag növekedésével, ill. A nemi kromoszómák ezen anomáliái a veleszületett és szerzett kardiovaszkuláris betegségek, valamint a cukorbetegség, a petefészek-elégtelenség és más betegségek miatti megbetegedéssel és mortalitással járnak együtt.

A kardiovaszkuláris fenotípusokat, valamint a gének expresszióját és aktiválódását egészséges nőkben és férfiakban vizsgálják a Turner- és Klinefelter-szindrómák összehasonlításával, keresztmetszeti leíró tervben. Ezeket a vizsgálatokat már elvégezték, és pontos jellemzés készült. A hipotézis az, hogy az X-kromoszóma jelentősége a különböző kardiovaszkuláris fenotípusokkal összefüggésben megváltozott expressziós és aktivációs szintekben nyilvánul meg. Másodsorban az Y-kromoszómáról analóg alapvető ismereteket biztosítunk. A projekt várhatóan további hipotéziseket generál a genom morbiditásban játszott szerepéről mind a normál kariotípusú populációban, mind a kóros kariotípusokban.

Ebben a projektben a frontvonal molekuláris technológiák és a jól meghatározott betegcsoportok egyedülálló kombinációját biztosítjuk. Az általunk tesztelt hipotézisek a következők:

1. Az X kromoszómából származó nem kódoló átiratok alapvető szerepet játszanak a nemi kromoszóma rendellenességekben, és az epigenetikai mechanizmusok szabályozásán és az mRNS destabilizációján keresztül működhetnek
2. Az X-kromoszómák nem kódoló RNS-expressziójának szabályozása olyan epigenetikai mechanizmusokon alapul, amelyek különböző hisztonjelekhez és eltérő DNS-metilációhoz vezetnek, például Turner- és Klinefelter-szindrómás betegekben, összehasonlítva az egészséges nemű kontrollokkal.
3. Az e mechanizmusokból eredő génexpressziós mintázat a nemi kromoszóma-rendellenességekben különbözik az egészséges férfiakhoz és nőkhöz viszonyítva, és ez a különbség a Turner-szindrómás nők beteg szöveteiben és a normál kontrollszövethez viszonyítva is vizsgálható.
4. A Turner- és Klinefelter-szindrómás betegek beteg szöveteiben egy vagy néhány olyan mozgató molekula azonosítása lehetséges, amelyek in vitro és in vivo validálhatók, és amelyek magyarázatot adhatnak a betegség folyamataira, fontos patofiziológiai információkat adva.

Várható leletek. Arra számítunk, hogy képesek leszünk az X-kromoszómák epigenetikai változásait egyetlen bázis felbontással meghatározni, így azonosítani tudjuk a CpG metilációt a DNS-szálakban, valamint a hisztonokban a permisszív és represszív hisztonnyomokat.

Mind az mRNS, mind a nem kódoló RNS-ek (hosszú és mikroRNS-ek) transzkriptumának azonosítását várjuk az X-kromoszómából generált RNS-ek esetében.

Arra számítunk, hogy képes leszünk egy atlaszt adni a Turner-szindrómákra jellemző epigenetikai eseményekről és ezeknek a transzkriptomra gyakorolt ​​hatásairól.

Bioinformatikai módszerek alkalmazásával ez remélhetőleg új, szabályozatlan molekulák azonosításához vezet, amelyek magyarázatot adhatnak ezeknek a betegeknek a különféle tulajdonságaira. Ezeket a molekulákat ezután külön betegcsoportokban validálják PCR vagy IHC technológia alkalmazásával.

Beteg szövetben megvizsgáljuk az X kromoszómák epigenomjának és transzkriptumának szövetspecifikus elváltozásait, és ezt összehasonlítjuk a kontroll mintákból származó normál szövetekkel. Reméljük, hogy ez a kórfolyamat mozgatórugóinak azonosításához és a betegség folyamatának patofiziológiai megértéséhez vezet.