X-kromosominaktivering, epigenetikk og transkriptomet

X-kromosomet er en hjørnestein i patogenesen av en rekke syndromer, hvorav noen er Turner syndrom (45,X), Klinefelter syndrom (47,XXY), trippel X syndrom (47,XXX) og dobbelt Y syndrom (47,XYY) ). Til tross for denne betydningen for klinisk sykdom, har bare ett gen på X-kromosomet så langt vært implisert i det brede spekteret av fenotypiske egenskaper sett i disse og andre X-relaterte syndromer. Det ene kjente genet er SHOX-genet (det kortvokste homeobox-genet) og koder for en transkripsjonsfaktor som har hjernens natriuretiske peptid (BNP) og fibroblastvekstfaktorreseptorgenet (FGFR3) som transkripsjonsmål. Den ligger i den pseudoautosomale regionen til X- og Y-kromosomene. Dette genet har vist seg å være involvert i kortvoksthet ved Turners syndrom, Leri-Weill syndrom og idiopatisk kortvoksthet. Det forårsaker også økt statur i Klinefelter syndrom, trippel X syndrom og XYY syndrom.

En rekke egenskaper og sykdommer sees hyppig ved X-kromosomale syndromer som ikke kan forklares med dette SHOX-genet. Det best karakteriserte av disse syndromene er Turners syndrom, hvor disse fenotypetrekkene kan deles inn i:

1. Autoimmun forkjærlighet, som fører til økt risiko for praktisk talt alle autoimmune sykdommer med ukjent patogenese som diabetes og hypotyreose.
2. Redusert intrauterin levedyktighet. Her er haploinsuffisiens av X-koblede pseudoautosomale gener som opererer i placenta blitt foreslått å være involvert (STS og CSF2RA).
3. Ovarial dysgenese, som fører til ovarieinsuffisiens og behov for langvarig kjønnshormonerstatningsterapi.
4. Medfødte kardiovaskulære misdannelser av uløste patogeneser.
5. Hjerneutvikling, spesielt sosial-kognitiv utvikling, som i mange tilfeller endres, ofte i en mer "mannlignende" retning.
6. Økt forekomst av metabolsk syndrom og osteoporose. I friske kvinneceller, med to X-kromosomer, skjer tilfeldig X-inaktivering (13). Prosessen styres av X-inaktiveringssenteret (XIC) og initiert av Xist som er et gen som koder for et langt mellomliggende ikke-kodende RNA (lincRNA). Xist-genet er lokalisert nær sentromeren på den lange armen til X-kromosomet, hvorfra det orkestrerer undertrykkende histonmodifikasjoner (rekrutterer PRC2) langs X-kromosomet som fører til inaktivering. I det gjenværende aktive X-kromosomet titreres PRC2 bort av Tsix, som effektivt etterlater alle hunner som mosaikk for X-kromosomet med en av mors og en av fars opprinnelse. Et stort antall gener som er spredt på X-kromosomet slipper imidlertid unna denne X-inaktiveringen ved ukjente mekanismer og doseringskompensasjon finner sted, slik at uttrykket mellom hanner og kvinner er sammenlignbare for mange gener (15, 16). Omtrent 65 % av genene er fullstendig stilnet, mens 15 % unnslipper X-inaktivering fullstendig, og 20 % viser variabel uttrykk, avhengig av vevscelleopprinnelse (17).

LincRNA-er er gjennomgående transkribert i genomet, selv om deres rolle i helse og sykdom er dårlig forstått. Studier av doseringskompensasjon, imprinting og homøotisk genuttrykk antyder at lincRNA fungerer i grensesnittet mellom DNA og kromatinremodellering med ytterligere involvering i omprogrammering av kromatin for å fremme kreftmetastase. Til dags dato er det antatt en rekke forskjellige interaksjoner for lincRNA-er i transkripsjonsregulering, og de kan fungere både som intakte interagerende molekyler så vel som Dicer-bearbeidede molekyler som er hakket til små forstyrrende RNA-er som bryter ned andre RNA-er.

Kromatinremodellering kan analyseres av merkene etter histoner på DNA-tråden, som kan være av enten tillatende eller undertrykkende natur, avhengig av acetyleringen eller metyleringen som finner sted av histonene. Som et eksempel er trimetylering av lysin 4 på histon H3 (H3K4me3) anriket ved transkripsjonelt aktive genpromotere, mens trimetylering av H3K9 (H3Kme3) og H3K27 (H3K27me3) er tilstede ved genpromotere som er transkripsjonelt undertrykt. Ved bruk av kromatin-immunutfelling kombinert med dyp sekvensering (chIPseq) kan man oppnå disse merkene langs hele X-kromosomet i en analyse.

De epigenetiske endringene av histonmodifikasjoner kan studeres med en ny metodikk, som muliggjør bruk av relativt gamle patologiske prøver. Dette åpner nye muligheter for utvidelse av vår kunnskap om rollen til den X-kromosomale tillatelsen og inaktiveringen for forskjellige sykdommer, der X-kromosomale syndromer kan tjene som den første modellen for å forstå slike prosesser som med stor sannsynlighet er viktige for sykdommer (f. diabetes og hypotyreose) utover disse syndromene. Som et annet eksempel er medfødte misdannelser i hjertet hyppige ved Turners syndrom og fører ofte til tidlig aorta dilatasjon og disseksjon. Hos disse pasientene og i kontrollene samler vi parafininnstøpte vevsblokker fra aortaveggen, som nå kan vurderes ved hjelp av denne frontlinjemetodikken med potensial til å identifisere nye merker på Turner-pasienters DNA sammenlignet med DNA fra ikke-Turner-pasienter.

Imprinting er et annet viktig aspekt ved sexkromosomhandling. Imprinting refererer til prosessen der et gen (eller flere gener) kan være preget avhengig av foreldrenes opprinnelse. Sagt på en annen måte, et gen kan "slå på eller av" avhengig av dets mors opprinnelse. Videre viser musestudier at klynger av gener på X-kromosomet er påtrykt og er uavhengige av X-kromosominaktivering.

Betydningen av den biologiske arven er tydelig for de store kardiovaskulære sykdommene som påvirker befolkningen, hvor en arvelig egenskap tydelig råder i visse familier. Til tross for et løfte om målretting mot forebygging og behandling av kardiovaskulær sykelighet, gjenstår de spesifikke delene av genomet som potensielt utløser patologiene i stor grad å bli definert, og kan gi viktig kunnskap om patofysiologien.

Den største kunnskapen om implikasjonene av genomavvik stammer fra sykdommer med åpenbare og alvorlige manifestasjoner som følge av klare overføringsmåter som tillater identifikasjon av de forårsakende områdene i genomet. Slike genetiske lidelser har potensialet for å forstå rollen til et spesifikt locus av genomet, hvis dette kan identifiseres, da store kromosomale regioner ofte er involvert. Når det gjelder de X-kromosomale fenotypene, forventer vi at det forårsakende middelet er på X-kromosomet, og vil bruke forskjellige nye teknologier for å identifisere dette middelet.

Foreløpig kommer vår begrensede kunnskap om X-kromosomets betydning for kardiovaskulær patologi fra enkeltgenforstyrrelser, og mer uspesifikke kjønnsforskjeller i tillegg til de kjønnskromosomale anomaliene. I motsetning til dette er det ikke påvist noen enkelt-genforstyrrelser på Y-kromosomet som er relatert til kardiovaskulær sykelighet.

Passende menneskelige modeller for forbedret forståelse av rollen som kjønnskromosomene spiller er tilgjengelige. Her forekommer avvik fra normalitet ikke bare med en rimelig prevalens, men assosieres også med lett identifiserbare fenotyper og ugunstig prognose. Turner og Klinefelters syndromer utgjør slike modeller; kvinner med reduksjon i X-kromosomalt materiale og hanner med økning i X-kromosomalt materiale, henholdsvis. Disse anomaliene i kjønnskromosomene er assosiert med overskytende sykelighet og dødelighet fra både medfødt og ervervet kardiovaskulær samt diabetes, ovarieinsuffisiens og andre sykdommer.

De kardiovaskulære fenotypene og uttrykket og aktiveringen av gener undersøkes hos friske kvinner og menn med en sammenligning mellom Turner og Klinefelters syndromer i et tverrsnitts beskrivende design. Disse studiene er allerede utført og en presis karakterisering er etablert. Hypotesen er at betydningen av X-kromosomet vil manifestere seg som endrede nivåer av uttrykk og aktivering i forbindelse med ulike kardiovaskulære fenotyper. Sekundært gis grunnleggende analog kunnskap om Y-kromosomet. Prosjektet forventes å generere ytterligere hypoteser om rollen som genomet spiller for sykelighet i både befolkningen som har en normal karyotype så vel som i unormale karyotyper.

I dette prosjektet vil vi gi en unik kombinasjon av frontlinje molekylære teknologier og veldefinerte pasientkohorter. Hypotesene vi skal teste er følgende:

1. Ikke-kodende transkripsjoner fra X-kromosomet spiller en grunnleggende rolle i kjønnskromosomavvik, og kan virke gjennom regulering av epigenetiske mekanismer og gjennom mRNA-destabilisering
2. Reguleringen av ikke-kodende RNA-ekspresjon på X-kromosomer er basert på epigenetiske mekanismer som fører til forskjellige histonmerker, og forskjellig DNA-metylering hos for eksempel personer med Turner og Klinefelters syndrom sammenlignet med friske kjønnsmatchede kontroller.
3. Genekspresjonsmønsteret som følge av disse mekanismene er forskjellig i kjønnskromosomavvik sammenlignet med friske menn og kvinner, og denne forskjellen kan studeres i sykt vev fra kvinner med Turner syndrom og sammenlignet med normalt kontrollvev.
4. Det kan være mulig å identifisere ett eller noen få drivermolekyler i sykt vev fra personer med Turner og Klinefelter syndrom, som kan valideres in vitro og in vivo og som kan forklare sykdomsprosessene, og gi viktig patofysiologisk informasjon.

Forventede funn. Vi forventer å være i stand til å definere de epigenetiske endringene ved X-kromosomene ved en enkelt baseoppløsning, og dermed identifisere CpG-metylering ved DNA-trådene så vel som permissive og undertrykkende histonmerker i histoner.

Vi forventer å identifisere transkriptomet både når det gjelder mRNA og ikke-kodende RNA (lange så vel som mikroRNA) for RNA generert fra X-kromosomet.

Vi forventer å kunne gi et atlas over epigenetiske hendelser spesifikke for Turners syndromer og effektene av disse på transkriptomet.

Ved å bruke bioinformatiske metoder vil dette forhåpentligvis føre til identifisering av nye dysregulerte molekyler som kan forklare ulike egenskaper til disse pasientene. Disse molekylene vil deretter bli gjenstand for validering i separate pasientkohorter ved bruk av PCR- eller IHC-teknologi.

I sykt vev vil vi studere de vevsspesifikke endringene av epigenomet og transkriptomet til X-kromosomene og sammenligne dette med normalt vev fra kontrollprøvene. Vi håper dette vil føre til identifisering av driverne for sykdomsprosessen og en patofysiologisk forståelse av sykdomsprosessen.