X-kromosominaktivering, epigenetik och transkriptom

X-kromosomen är en hörnsten i patogenesen av ett antal syndrom, varav några är Turners syndrom (45,X), Klinefelters syndrom (47,XXY), trippel X-syndrom (47,XXX) och dubbelt Y-syndrom (47,XYY) ). Trots denna betydelse för klinisk sjukdom har endast en gen på X-kromosomen hittills varit inblandad i det breda spektra av fenotypiska egenskaper som ses i dessa och andra X-relaterade syndrom. Den ena kända genen är SHOX-genen (den kortväxta homeobox-genen) och kodar för en transkriptionsfaktor som har hjärnans natriuretiska peptid (BNP) och fibroblasttillväxtfaktorreceptorgenen (FGFR3) som transkriptionella mål. Det är beläget i den pseudoautosomala regionen av X- och Y-kromosomerna. Denna gen har visat sig vara involverad i kortväxthet vid Turners syndrom, Leri-Weills syndrom och idiopatisk kortväxthet. Det orsakar också den ökade växtligheten vid Klinefelters syndrom, trippel X-syndrom och XYY-syndrom.

Ett antal egenskaper och sjukdomar ses ofta i X-kromosomala syndrom som inte kan förklaras av denna SHOX-gen. Det bäst karakteriserade av dessa syndrom är Turners syndrom, där dessa fenotypegenskaper kan delas in i:

1. Autoimmun förkärlek, vilket leder till en ökad risk för i stort sett alla autoimmuna sjukdomar av okänd patogenes som diabetes och hypotyreos.
2. Minskad intrauterin livsduglighet. Här har haploinsufficiens av X-kopplade pseudoautosomala gener som verkar i placentan föreslagits vara involverade (STS och CSF2RA).
3. Ovarial dysgenes, vilket leder till ovarieinsufficiens och behovet av långvarig könshormonersättningsterapi.
4. Medfödda kardiovaskulära missbildningar av olösta patogener.
5. Hjärnans utveckling, särskilt social-kognitiv utveckling, som förändras i många fall, ofta i en mer "mansliknande" riktning.
6. Ökad förekomst av det metabola syndromet och osteoporos. I friska kvinnors celler, med två X-kromosomer, sker slumpmässig X-inaktivering (13). Processen styrs av X-inaktiveringscentret (XIC) och initieras av Xist som är en gen som kodar för ett långt mellanliggande icke-kodande RNA (lincRNA). Xist-genen är belägen nära centromeren på X-kromosomens långa arm, varifrån den orkestrerar repressiva histonmodifikationer (rekryterar PRC2) längs X-kromosomen som leder till inaktivering. I den återstående aktiva X-kromosomen titreras PRC2 bort av Tsix, vilket effektivt lämnar alla honor som mosaiker för X-kromosomen med en av moderlig och en av faderlig ursprung. Men ett stort antal gener som är utspridda på X-kromosomen slipper denna X-inaktivering genom okända mekanismer och doskompensation sker, så att uttrycket mellan män och kvinnor är jämförbart för många gener (15, 16). Ungefär 65 % av generna tystas helt, medan 15 % helt undviker X-inaktivering och 20 % visar variabelt uttryck, beroende på vävnadscellernas ursprung (17).

LincRNA transkriberas genomgående i genomet, även om deras roll i hälsa och sjukdom är dåligt förstådd. Studier av doskompensation, imprinting och homeotiskt genuttryck tyder på att lincRNA fungerar i gränssnittet mellan DNA och kromatinombyggnad med ytterligare inblandning i omprogrammering av kromatin för att främja cancermetastaser. Hittills har en rad olika interaktioner antagits för lincRNA vid transkriptionsreglering, och de kan fungera både som intakta interagerande molekyler såväl som Dicer-bearbetade molekyler som hackas till små störande RNA som bryter ned andra RNA.

Kromatinremodellering kan analyseras av de märken som lämnas av histoner på DNA-strängen, som kan vara av antingen tillåtande eller repressiv karaktär, beroende på acetyleringen eller metyleringen som äger rum av histonerna. Som ett exempel anrikas trimetylering av lysin 4 på histon H3 (H3K4me3) vid transkriptionellt aktiva genpromotorer, medan trimetylering av H3K9 (H3Kme3) och H3K27 (H3K27me3) är närvarande vid genpromotorer som är transkriptionellt undertryckta. Genom att använda kromatinimmunfällning i kombination med djup sekvensering (chIPseq) kan man få dessa märken längs hela X-kromosomen i en analys.

De epigenetiska förändringarna av histonmodifieringar kan studeras med en ny metod, som möjliggör användning av relativt gamla patologiska prover. Detta öppnar nya möjligheter för att utöka vår kunskap om rollen av X-kromosomala tillstånd och inaktivering för olika sjukdomar, där X-kromosomala syndrom kan fungera som den initiala modellen för att förstå sådana processer som med stor sannolikhet är viktiga för sjukdomar (t. diabetes och hypotyreos) utöver dessa syndrom. Som ett annat exempel är medfödda missbildningar i hjärtat vanliga vid Turners syndrom och leder ofta till tidig aortadilation och dissektion. Hos dessa patienter och i kontroller samlar vi in ​​paraffininbäddade block av vävnad från aortaväggen, som nu kan bedömas med denna frontlinjemetodik med potential att identifiera nya märken på Turner-patienters DNA jämfört med DNA från icke-Turner-patienter.

Imprinting är en annan viktig aspekt av könskromosomverkan. Imprinting hänvisar till processen där en gen (eller flera gener) kan präglas beroende på förälders ursprung. Med andra ord kan en gen "slå på eller av" beroende på dess moder av faderligt ursprung. Dessutom visar musstudier att kluster av gener på X-kromosomen är präglade och är oberoende av X-kromosominaktivering.

Betydelsen av det biologiska arvet är uppenbart för de stora kardiovaskulära sjukdomar som drabbar befolkningen, där en ärftlig egenskap tydligt råder i vissa familjer. Trots ett löfte om att rikta in sig på förebyggande och behandling av kardiovaskulär sjuklighet, återstår de specifika delarna av genomet som potentiellt utlöser patologierna i stort sett att definieras och skulle kunna ge viktig kunskap om patofysiologin.

Den stora mängden kunskap om konsekvenserna av genomavvikelser härrör från sjukdomar med uppenbara och allvarliga manifestationer som är resultatet av tydliga överföringssätt som tillåter identifiering av de orsakande regionerna i genomet. Sådana genetiska störningar har potentialen för att förstå rollen av ett specifikt locus i genomet, om detta kan identifieras, eftersom stora kromosomala regioner ofta är involverade. När det gäller X-kromosomala fenotyper förväntar vi oss att orsaksmedlet finns på X-kromosomen och kommer att använda olika nya teknologier för att identifiera detta agens.

För närvarande kommer vår begränsade kunskap om X-kromosomens betydelse för kardiovaskulär patologi från enstaka genstörningar, och mer ospecifika könsskillnader utöver de könskromosomala anomalierna. Däremot har ingen enstaka genstörning på Y-kromosomen fastställts vara relaterad till kardiovaskulär sjuklighet.

Lämpliga mänskliga modeller för förbättrad förståelse av rollen som könskromosomerna spelar finns tillgängliga. Här förekommer avvikelser från normalitet inte bara vid en rimlig prevalens utan associeras också med lätt identifierbara fenotyper och ogynnsam prognos. Turners och Klinefelters syndrom utgör sådana modeller; honor med en minskning av X-kromosomalt material respektive män med en ökning av X-kromosomalt material. Dessa anomalier i könskromosomerna förknippas med överdriven sjuklighet och dödlighet från både medfödd och förvärvad kardiovaskulär samt diabetes, ovarieinsufficiens och andra sjukdomar.

De kardiovaskulära fenotyperna och uttrycket och aktiveringen av gener undersöks hos friska kvinnor och män med en jämförelse mellan Turners och Klinefelters syndrom i en tvärsnittsdeskriptiv design. Dessa studier har redan utförts och en exakt karakterisering har fastställts. Hypotesen är att X-kromosomens betydelse kommer att visa sig som förändrade nivåer av uttryck och aktivering i samband med olika kardiovaskulära fenotyper. Sekundärt tillhandahålls grundläggande analog kunskap om Y-kromosomen. Projektet förväntas generera ytterligare hypoteser om vilken roll genomet spelar för sjuklighet i både populationen med normal karyotyp och onormala karyotyper.

I detta projekt kommer vi att tillhandahålla en unik kombination av frontlinjens molekylära teknologier och väldefinierade patientkohorter. Hypoteserna vi ska testa är följande:

1. Icke-kodande transkript från X-kromosomen spelar en grundläggande roll i könskromosomavvikelser och kan fungera genom reglering av epigenetiska mekanismer och genom mRNA-destabilisering
2. Regleringen av icke-kodande RNA-uttryck på X-kromosomer är baserad på epigenetiska mekanismer som leder till olika histonmärken och olika DNA-metylering hos t.ex. Turner och Klinefelters syndrom personer jämfört med friska könsmatchade kontroller.
3. Genuttrycksmönstret som härrör från dessa mekanismer skiljer sig i könskromosomavvikelser i jämförelse med friska män och kvinnor, och denna skillnad kan studeras i sjuka vävnader från kvinnor med Turners syndrom och jämföras med normal kontrollvävnad.
4. Det kan vara möjligt att identifiera en eller ett fåtal drivmolekyler i sjuka vävnader från personer med Turner och Klinefelters syndrom, som kan valideras in vitro och in vivo och som kan förklara sjukdomsprocesserna, vilket ger viktig patofysiologisk information.

Förväntade fynd. Vi förväntar oss att kunna definiera de epigenetiska förändringarna vid X-kromosomerna vid en enda basupplösning, och därmed identifiera CpG-metylering vid DNA-strängarna såväl som tillåtande och repressiva histonmärken i histoner.

Vi förväntar oss att identifiera transkriptomet både vad gäller mRNA och icke-kodande RNA (långa såväl som mikroRNA) för RNA genererade från X-kromosomen.

Vi förväntar oss att kunna tillhandahålla en atlas över epigenetiska händelser som är specifika för Turners syndrom och effekterna av dessa på transkriptomet.

Med hjälp av bioinformatiska metoder kommer detta förhoppningsvis att leda till identifiering av nya dysreglerade molekyler som kan förklara olika egenskaper hos dessa patienter. Dessa molekyler kommer sedan att bli föremål för validering i separata patientkohorter med PCR- eller IHC-teknik.

I sjuk vävnad kommer vi att studera de vävnadsspecifika förändringarna av epigenomet och transkriptomen av X-kromosomerna och jämföra detta med normala vävnader från kontrollproverna. Vi hoppas att detta kommer att leda till identifiering av drivkrafterna för sjukdomsprocessen och en patofysiologisk förståelse av sjukdomsprocessen.