Inativação do cromossomo X, epigenética e o transcriptoma

O cromossomo X é a pedra angular da patogênese de várias síndromes, algumas das quais são a síndrome de Turner (45,X), a síndrome de Klinefelter (47,XXY), a síndrome do triplo X (47,XXX) e a síndrome do duplo Y (47,XYY). ). Apesar dessa importância para a doença clínica, até agora apenas um gene no cromossomo X foi implicado no amplo espectro de características fenotípicas observadas nessas e em outras síndromes relacionadas ao X. O único gene conhecido é o gene SHOX (o homeobox de baixa estatura) e codifica um fator de transcrição que tem o peptídeo natriurético cerebral (BNP) e o gene do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) como alvos de transcrição. Está localizado na região pseudoautossômica dos cromossomos X e Y. Foi demonstrado que esse gene está envolvido na baixa estatura na síndrome de Turner, na síndrome de Leri-Weill e na baixa estatura idiopática. Também causa o aumento da estatura na síndrome de Klinefelter, na síndrome do triplo X e na síndrome XYY.

Uma série de características e doenças são vistas com frequência nas síndromes do cromossomo X que não podem ser explicadas por este gene SHOX. A mais bem caracterizada dessas síndromes é a síndrome de Turner, onde esses traços fenótipos podem ser divididos em:

1. Predileção autoimune, que leva a um risco aumentado de praticamente todas as doenças autoimunes de patogênese desconhecida, como diabetes e hipotireoidismo.
2. Viabilidade intrauterina diminuída. Aqui foi sugerido que a haploinsuficiência de genes pseudoautossômicos ligados ao X operando na placenta está envolvida (STS e CSF2RA).
3. Disgenesia ovariana, levando à insuficiência ovariana e à necessidade de terapia de reposição hormonal de longo prazo.
4. Malformações cardiovasculares congênitas de patogêneses não resolvidas.
5. O desenvolvimento do cérebro, especialmente o desenvolvimento sociocognitivo, que é alterado em muitos casos, geralmente em uma direção mais "masculina".
6. Prevalência aumentada da síndrome metabólica e da osteoporose. Nas células de mulheres saudáveis, com dois cromossomos X, ocorre a inativação aleatória do X (13). O processo é governado pelo centro de inativação do X (XIC) e iniciado pelo Xist, que é um gene que codifica um RNA não codificante de longa intervenção (lincRNA). O gene Xist está localizado próximo ao centrômero no braço longo do cromossomo X, de onde orquestra modificações repressivas de histonas (recrutando PRC2) ao longo do cromossomo X levando à inativação. No cromossomo X ativo restante, o PRC2 é titulado por Tsix, o que efetivamente deixa todas as mulheres como mosaicos para o cromossomo X com um de origem materna e outro paterno. No entanto, um grande número de genes espalhados no cromossomo X escapa dessa inativação do X por mecanismos desconhecidos e ocorre uma compensação de dosagem, de modo que a expressão entre machos e fêmeas é comparável para muitos genes (15, 16). Aproximadamente 65% dos genes são totalmente silenciados, enquanto 15% escapam completamente da inativação do X e 20% apresentam expressão variável, dependendo da origem da célula tecidual (17).

LincRNAs são amplamente transcritos no genoma, embora seu papel na saúde e na doença seja pouco compreendido. Estudos de compensação de dosagem, imprinting e expressão gênica homeótica sugerem que os lincRNAs funcionam na interface entre o DNA e a remodelação da cromatina com maior envolvimento na reprogramação da cromatina para promover a metástase do câncer. Até o momento, uma série de diferentes interações foram hipotetizadas para lincRNAs na regulação da transcrição, e eles podem funcionar tanto como moléculas de interação intactas quanto como moléculas processadas por Dicer que são cortadas em pequenos RNAs interferentes que degradam outros RNAs.

A remodelação da cromatina pode ser analisada pelas marcas deixadas pelas histonas na fita de DNA, que podem ser de natureza permissiva ou repressiva, dependendo da acetilação ou metilação que ocorre nas histonas. Como exemplo, a trimetilação da lisina 4 na histona H3 (H3K4me3) é enriquecida em promotores de genes transcricionalmente ativos, enquanto a trimetilação de H3K9 (H3Kme3) e H3K27 (H3K27me3) está presente em promotores de genes que são reprimidos transcricionalmente. Pelo uso da imunoprecipitação da cromatina juntamente com o sequenciamento profundo (chIPseq), pode-se obter essas marcas ao longo de todo o cromossomo X em um ensaio.

As alterações epigenéticas das modificações das histonas podem ser estudadas por uma nova metodologia, possibilitando o uso de espécimes patológicos relativamente antigos. Isso abre novas perspectivas para a expansão de nosso conhecimento sobre o papel da permissão e inativação do cromossomo X para diferentes doenças, onde as síndromes do cromossomo X podem servir como modelo inicial para entender tais processos que são altamente prováveis ​​de serem importantes para doenças (por exemplo, diabetes e hipotireoidismo) além dessas síndromes. Como outro exemplo, as malformações congênitas do coração são frequentes na síndrome de Turner e muitas vezes levam à dilatação e dissecção aórtica precoces. Nesses pacientes e nos controles, coletamos blocos de tecido embebidos em parafina da parede da aorta, que agora podem ser avaliados usando essa metodologia de linha de frente com potencial para identificar novas marcas no DNA de pacientes com Turner em comparação com o DNA de pacientes não Turner.

O imprinting é outro aspecto importante da ação dos cromossomos sexuais. Imprinting refere-se ao processo em que um gene (ou mais genes) pode ser impresso dependendo da origem parental. Dito de outra forma, um gene pode ser "ligado ou desligado" dependendo de sua origem materna ou paterna. Além disso, estudos com camundongos mostram que grupos de genes no cromossomo X são impressos e são independentes da inativação do cromossomo X.

A importância da herança biológica é evidente para as principais morbidades cardiovasculares que afetam a população, onde prevalece claramente um traço hereditário em certas famílias. Apesar da promessa de direcionar a prevenção e tratamento da morbidade cardiovascular, as partes específicas do genoma que potencialmente desencadeiam as patologias ainda precisam ser definidas e podem trazer importantes conhecimentos da fisiopatologia.

O maior corpo de conhecimento sobre as implicações das aberrações genômicas origina-se de doenças com manifestações óbvias e graves resultantes de modos claros de transmissão que permitem a identificação das regiões causadoras do genoma. Esses distúrbios genéticos têm o potencial para entender o papel de um locus específico do genoma, se isso puder ser identificado, pois grandes regiões cromossômicas geralmente estão envolvidas. No caso dos fenótipos do cromossomo X, esperamos que o agente causador esteja no cromossomo X e usaremos várias novas tecnologias para identificar esse agente.

Atualmente, nosso conhecimento limitado da importância do cromossomo X para a patologia cardiovascular vem de distúrbios de um único gene e diferenças de gênero mais inespecíficas, além das anomalias cromossômicas sexuais. Em contraste, nenhum distúrbio de gene único no cromossomo Y foi estabelecido como relacionado à morbidade cardiovascular.

Modelos humanos apropriados para uma melhor compreensão do papel desempenhado pelos cromossomos sexuais estão disponíveis. Aqui, os desvios da normalidade não ocorrem apenas com uma prevalência razoável, mas também se associam a fenótipos facilmente identificáveis ​​e prognósticos adversos. As síndromes de Turner e Klinefelter constituem tais modelos; fêmeas com redução do material cromossômico X e machos com aumento do material cromossômico X, respectivamente. Essas anomalias dos cromossomos sexuais associam-se com excesso de morbidade e mortalidade por doenças cardiovasculares congênitas e adquiridas, bem como diabetes, insuficiência ovariana e outras doenças.

Os fenótipos cardiovasculares e a expressão e ativação de genes são investigados em mulheres e homens saudáveis ​​com uma comparação entre as síndromes de Turner e Klinefelter em um desenho descritivo transversal. Esses estudos já foram realizados e uma caracterização precisa está estabelecida. A hipótese é que o significado do cromossomo X se manifestará como níveis alterados de expressão e ativação em associação com diferentes fenótipos cardiovasculares. Secundariamente, é fornecido conhecimento análogo básico do cromossomo Y. Espera-se que o projeto gere novas hipóteses sobre o papel desempenhado pelo genoma na morbidade tanto na população com cariótipo normal quanto na população com cariótipo anormal.

Neste projeto, forneceremos uma combinação única de tecnologias moleculares de linha de frente e coortes de pacientes bem definidas. As hipóteses que testaremos são as seguintes:

1. Os transcritos não codificantes do cromossomo X desempenham um papel fundamental nas anormalidades dos cromossomos sexuais e podem funcionar por meio da regulação de mecanismos epigenéticos e da desestabilização do mRNA
2. A regulação da expressão de RNA não codificante nos cromossomos X é baseada em mecanismos epigenéticos que levam a diferentes marcas de histonas e diferentes metilações de DNA em, por exemplo, pessoas com síndrome de Turner e Klinefelter quando comparadas a controles saudáveis ​​de gênero compatível.
3. O padrão de expressão gênica resultante desses mecanismos é diferente nas anormalidades dos cromossomos sexuais em comparação com homens e mulheres saudáveis, e essa diferença pode ser estudada em tecidos doentes de mulheres com síndrome de Turner e em comparação com tecidos normais de controle.
4. Pode ser possível identificar uma ou algumas moléculas condutoras em tecidos doentes de pessoas com síndrome de Turner e Klinefelter, que podem ser validadas in vitro e in vivo e que podem explicar os processos da doença, fornecendo importantes informações fisiopatológicas.

Descobertas esperadas. Esperamos ser capazes de definir as alterações epigenéticas nos cromossomos X em uma única resolução de base, identificando assim a metilação CpG nas fitas de DNA, bem como marcas de histonas permissivas e repressivas em histonas.

Esperamos identificar o transcriptoma tanto em relação ao mRNA quanto aos RNAs não codificantes (tanto quanto aos microRNAs) para os RNAs gerados a partir do cromossomo X.

Esperamos poder fornecer um Atlas dos eventos epigenéticos específicos para as síndromes de Turner e os efeitos destes no transcriptoma.

Usando métodos bioinformáticos, espera-se que isso leve à identificação de novas moléculas desreguladas que possam explicar várias propriedades desses pacientes. Essas moléculas serão então sujeitas a validação em coortes de pacientes separadas usando PCR ou tecnologia IHC.

No tecido doente, estudaremos as alterações específicas do tecido do epigenoma e transcriptoma dos cromossomos X e compararemos isso com tecidos normais das amostras de controle. Esperamos que isso leve à identificação dos condutores do processo da doença e a uma compreensão fisiopatológica do processo da doença.