Inattivazione del cromosoma X, epigenetica e trascrittoma

Il cromosoma X è una pietra angolare della patogenesi di un certo numero di sindromi, di cui alcune sono la sindrome di Turner (45,X), la sindrome di Klinefelter (47,XXY), la sindrome della tripla X (47,XXX) e la sindrome della doppia Y (47,XYY ). Nonostante questa importanza per la malattia clinica, finora solo un gene sul cromosoma X è stato implicato nell'ampio spettro di tratti fenotipici osservati in queste e in altre sindromi correlate all'X. L'unico gene noto è il gene SHOX (the short stature homeobox) e codifica un fattore di trascrizione che ha il peptide natriuretico cerebrale (BNP) e il gene del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGFR3) come bersagli trascrizionali. Si trova nella regione pseudoautosomica dei cromosomi X e Y. È stato dimostrato che questo gene è coinvolto nella bassa statura nella sindrome di Turner, nella sindrome di Leri-Weill e nella bassa statura idiopatica. Provoca anche l'aumento della statura nella sindrome di Klinefelter, nella sindrome della tripla X e nella sindrome XYY.

Nelle sindromi del cromosoma X si osservano frequentemente numerosi tratti e malattie che non possono essere spiegati da questo gene SHOX. La meglio caratterizzata di queste sindromi è la sindrome di Turner, in cui questi tratti fenotipici possono essere suddivisi in:

1. Predilezione autoimmune, che porta ad un aumento del rischio di quasi tutte le malattie autoimmuni di patogenesi sconosciuta come il diabete e l'ipotiroidismo.
2. Diminuzione della vitalità intrauterina. Qui è stato suggerito che sia coinvolta l'aploinsufficienza dei geni pseudoautosomici legati all'X operanti nella placenta (STS e CSF2RA).
3. Disgenesia ovarica, che porta all'insufficienza ovarica e alla necessità di una terapia sostitutiva ormonale sessuale a lungo termine.
4. Malformazioni cardiovascolari congenite di patogenesi irrisolte.
5. Lo sviluppo cerebrale, in particolare lo sviluppo socio-cognitivo, che in molti casi è alterato, spesso in una direzione più "maschile".
6. Aumento della prevalenza della sindrome metabolica e dell'osteoporosi. Nelle cellule di donne sane, con due cromosomi X, avviene l'inattivazione casuale dell'X (13). Il processo è governato dal centro di inattivazione X (XIC) e avviato da Xist che è un gene che codifica un lungo RNA non codificante interposto (lincRNA). Il gene Xist si trova vicino al centromero sul braccio lungo del cromosoma X, dove da esso orchestra modifiche istoniche repressive (reclutamento PRC2) lungo il cromosoma X che portano all'inattivazione. Nel restante cromosoma X attivo PRC2 viene titolato via da Tsix, che lascia effettivamente tutte le femmine come mosaici per il cromosoma X con una di origine materna e una di origine paterna. Tuttavia, un gran numero di geni che sono sparsi sul cromosoma X sfuggono a questa inattivazione dell'X da parte di meccanismi sconosciuti e avviene la compensazione del dosaggio, cosicché l'espressione tra maschi e femmine è paragonabile per molti geni (15, 16). Circa il 65% dei geni è completamente silenziato, mentre il 15% sfugge completamente all'inattivazione dell'X e il 20% mostra un'espressione variabile, a seconda dell'origine della cellula tissutale (17).

I lincRNA sono trascritti in modo pervasivo nel genoma, sebbene il loro ruolo nella salute e nella malattia sia poco conosciuto. Gli studi sulla compensazione del dosaggio, l'imprinting e l'espressione genica omeotica suggeriscono che i lincRNA funzionano all'interfaccia tra il rimodellamento del DNA e della cromatina con un ulteriore coinvolgimento nella riprogrammazione della cromatina per promuovere la metastasi del cancro. Ad oggi è stata ipotizzata una serie di interazioni diverse per i lincRNA nella regolazione trascrizionale, e possono funzionare sia come molecole interagenti intatte sia come molecole processate da Dicer che vengono tagliate in piccoli RNA interferenti che degradano altri RNA.

Il rimodellamento della cromatina può essere analizzato dai segni lasciati dagli istoni sul filamento di DNA, che possono essere di natura permissiva o repressiva, a seconda dell'acetilazione o della metilazione in atto negli istoni. Ad esempio, la trimetilazione della lisina 4 sull'istone H3 (H3K4me3) è arricchita in promotori genici trascrizionalmente attivi, mentre la trimetilazione di H3K9 (H3Kme3) e H3K27 (H3K27me3) è presente in promotori genici repressi trascrizionalmente. Mediante l'uso dell'immunoprecipitazione della cromatina unita al sequenziamento profondo (chIPseq) è possibile ottenere questi segni lungo l'intero cromosoma X in un'unica analisi.

Le alterazioni epigenetiche delle modificazioni istoniche possono essere studiate con una nuova metodologia, consentendo l'uso di esemplari patologici relativamente vecchi. Ciò apre nuove prospettive per l'espansione della nostra conoscenza del ruolo dell'autorizzazione e dell'inattivazione del cromosoma X a diverse malattie, in cui le sindromi del cromosoma X possono servire come modello iniziale per comprendere tali processi che sono molto probabilmente importanti per le malattie (ad es. diabete e ipotiroidismo) oltre a queste sindromi. Come altro esempio, le malformazioni congenite del cuore sono frequenti nella sindrome di Turner e spesso portano a una precoce dilatazione e dissezione aortica. In questi pazienti e nei controlli, raccogliamo blocchi di tessuto inclusi in paraffina dalla parete aortica, che ora possono essere valutati utilizzando questa metodologia di prima linea con un potenziale per identificare nuovi segni sul DNA dei pazienti Turner rispetto al DNA dei pazienti non Turner.

L'imprinting è un altro aspetto importante dell'azione del cromosoma sessuale. L'imprinting si riferisce al processo in cui un gene (o più geni) può essere impresso a seconda dell'origine parentale. In altre parole, un gene può essere "attivato o disattivato" a seconda della sua origine materna o paterna. Inoltre, studi sui topi mostrano che gruppi di geni sul cromosoma X sono impressi e sono indipendenti dall'inattivazione del cromosoma X.

L'importanza dell'eredità biologica è evidente per le principali morbilità cardiovascolari che colpiscono la popolazione, dove un tratto ereditario prevale nettamente in alcune famiglie. Nonostante la promessa di mirare alla prevenzione e al trattamento della morbilità cardiovascolare, le parti specifiche del genoma che potenzialmente scatenano le patologie rimangono in gran parte da definire e potrebbero portare importanti conoscenze sulla fisiopatologia.

Il maggior corpus di conoscenze sulle implicazioni delle aberrazioni del genoma proviene da malattie con manifestazioni evidenti e gravi risultanti da chiare modalità di trasmissione che consentono l'identificazione delle regioni causative del genoma. Tali malattie genetiche hanno il potenziale per comprendere il ruolo di un locus specifico del genoma, se questo può essere identificato, poiché spesso sono coinvolte grandi regioni cromosomiche. Nel caso dei fenotipi del cromosoma X ci aspettiamo che l'agente eziologico sia sul cromosoma X e utilizzeremo varie nuove tecnologie per identificare questo agente.

Attualmente, la nostra conoscenza limitata dell'importanza del cromosoma X per la patologia cardiovascolare deriva da disturbi monogenici e differenze di genere più non specifiche oltre alle anomalie cromosomiche sessuali. Al contrario, non è stato stabilito che nessun disturbo monogenico sul cromosoma Y sia correlato alla morbilità cardiovascolare.

Sono disponibili modelli umani appropriati per una migliore comprensione del ruolo svolto dai cromosomi sessuali. Qui, le deviazioni dalla normalità non solo si verificano con una ragionevole prevalenza, ma si associano anche a fenotipi facilmente identificabili e prognosi sfavorevole. Le sindromi di Turner e Klinefelter costituiscono tali modelli; femmine con una riduzione del materiale cromosomico X e maschi con un aumento del materiale cromosomico X, rispettivamente. Queste anomalie dei cromosomi sessuali si associano a un'eccessiva morbilità e mortalità per malattie cardiovascolari sia congenite che acquisite, nonché diabete, insufficienza ovarica e altre malattie.

I fenotipi cardiovascolari e l'espressione e l'attivazione dei geni sono studiati in femmine e maschi sani con un confronto tra le sindromi di Turner e Klinefelter in un disegno descrittivo trasversale. Questi studi sono già stati eseguiti e ne è stata stabilita una precisa caratterizzazione. L'ipotesi è che il significato del cromosoma X si manifesti come livelli alterati di espressione e attivazione in associazione con diversi fenotipi cardiovascolari. In secondo luogo, viene fornita una conoscenza analoga di base del cromosoma Y. Il progetto dovrebbe generare ulteriori ipotesi sul ruolo giocato dal genoma sulla morbilità sia nella popolazione con cariotipo normale che in quella con cariotipo anomalo.

In questo progetto forniremo una combinazione unica di tecnologie molecolari di prima linea e coorti di pazienti ben definite. Le ipotesi che verificheremo sono le seguenti:

1. Le trascrizioni non codificanti del cromosoma X svolgono un ruolo fondamentale nelle anomalie del cromosoma sessuale e possono funzionare attraverso la regolazione dei meccanismi epigenetici e attraverso la destabilizzazione dell'mRNA
2. La regolazione dell'espressione dell'RNA non codificante sui cromosomi X si basa su meccanismi epigenetici che portano a diversi segni istonici e a una diversa metilazione del DNA, ad esempio, nelle persone con sindrome di Turner e Klinefelter rispetto ai controlli sani abbinati per genere.
3. Il modello di espressione genica risultante da questi meccanismi è diverso nelle anomalie dei cromosomi sessuali rispetto a maschi e femmine sani, e questa differenza può essere studiata nei tessuti malati delle donne con sindrome di Turner e confrontata con il normale tessuto di controllo.
4. Potrebbe essere possibile identificare una o poche molecole guida nei tessuti malati di persone con sindrome di Turner e Klinefelter, che possono essere validate in vitro e in vivo e che possono spiegare i processi patologici, fornendo importanti informazioni fisiopatologiche.

Risultati attesi. Ci aspettiamo di essere in grado di definire i cambiamenti epigenetici nei cromosomi X con una singola risoluzione di base, identificando così la metilazione CpG nei filamenti di DNA così come i segni istonici permissivi e repressivi negli istoni.

Ci aspettiamo di identificare il trascrittoma sia per quanto riguarda l'mRNA che per gli RNA non codificanti (lunghi così come per i microRNA) per gli RNA generati dal cromosoma X.

Ci aspettiamo di poter fornire un Atlante degli eventi epigenetici specifici per le sindromi di Turner e gli effetti di questi sul trascrittoma.

L'uso di metodi bioinformatici porterà, si spera, all'identificazione di nuove molecole disregolate che potrebbero spiegare varie proprietà di questi pazienti. Queste molecole saranno quindi soggette a convalida in coorti di pazienti separate utilizzando la tecnologia PCR o IHC.

Nel tessuto malato studieremo le alterazioni tessuto-specifiche dell'epigenoma e del trascrittoma dei cromosomi X e le confronteremo con i tessuti normali dei campioni di controllo. Ci auguriamo che ciò porti all'identificazione dei driver del processo patologico e ad una comprensione fisiopatologica del processo patologico.