A Zika-vírus vertikális expozíciója és következményei a gyermekek idegrendszeri fejlődésére (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

A tanulmány fő célja a terhességtől a harmadik életév végéig terjedő vertikális ZIKV átvitel természetes anamnézisének felmérése, valamint a klinikai és neurológiai rendellenességek, különösen a mikrokefália előfordulásával összefüggő kockázati tényezők megléte.

A terhességtől a harmadik életév végéig longitudinális vizsgálatot végeznek, amely során a ZIKV fertőzés lesz a fő expozíció.

A minta mérete 500 zikavírusnak kitett gyermek lesz. A mintanagyságot a ritka eseményekre számították a Brazíliában szokásos mikrokefália prevalencia alapján (2:10 000) és a ZIKAV-nak kitett terhes nők körében várható megbetegedések számának növekedése.

A vizsgálatot a Fernandes Figueira Nemzeti Nők és Gyermekek Egészségügyi Intézetében (IFF) végzik. A várandós nőket az IFF terhesgondozási klinikáján és a Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF) családegészségügyi stratégiai egységein választják ki, amelyek mindkettő a FioCruz/RJ-től származik. Terhes nőt is toborozunk az SMS Rio de Janeiro klinikai családjából.

Bevonási kritériumok A vizsgálati populáció olyan terhes nőkből áll, akiknél a ZIKAV fertőzéssel összeegyeztethető tünetek jelentkeznek, bőrkiütéssel, ízületi gyulladással összefüggő lázzal, izomfájdalmakkal, nem gennyes kötőhártya-gyulladással vagy fejfájással, valamint tünetmentes terhes nőkből áll, akiknél az expozíció lehetőségét egyidejűleg azonosították. . RT-PCR pozitív betegeket is bevonunk.

Minden terhes nő, aki az IFF-en és a CSGSF-en prenatális nyomon követés alatt áll, függetlenül a terhességi kortól, kezdetben nem exponáltnak tekinthető.

Kizárási kritériumok Azok a terhes nők, akiknél a magzati életkor vagy születés során kromoszóma-rendellenességeket észleltek, kizárásra kerülnek.

Az expozíció meghatározása Tekintettel arra, hogy a ZIKAV fertőzések mintegy 80%-a tünetmentes, az expozíciót a diagnosztikai tesztek (PCR vagy szerológiai tesztek) pozitivitása igazolja. Tekintettel a szerológiai tesztek jövőbeni elérhetőségére, bizonyos stratégiákat alkalmaznak az expozíciós csoportok meghatározására, mivel eddig csak a PCR teszt áll rendelkezésre, amely csak a betegség akut fázisában marad pozitív.

A fent leírtak szerint a tünetekkel járó nőket fertőzésdiagnosztikai megerősítésre utalják RT-PCR-rel, és szerológiai teszteket végeznek dengue-láz, chikcungunha, CMV, toxoplazmózis és rubeola kimutatására.

A tünetekkel és tünetmentes nőktől a terhesség három trimeszterében és születéskor vérmintát vesznek szerológiai vizsgálatok céljából. A vérmintákat egy biorepozitóriumban tárolják a ZIKA szerológiai vizsgálatokhoz, amikor specifikus szerológiai tesztek állnak rendelkezésre. Ezeket a szekvenciális mintákat a fejlesztési szakaszban lévő szerológiai tesztek validálására is használják.

Az összehasonlítandó expozíciós csoportokat a szerológiai vizsgálatok eredményei alapján állítják össze. Azok a tünetmentesek, akiknek vérmintája a jövőben Zika-fertőzés jelenlétét jelzi, a kitettek csoportjába vándorolnak.

A specifikus tesztek (PCR az akut fázisban és szerológiai vizsgálatok később) pozitív eredményét mutató kohorsz terhes nőket fertőzésnek kitettnek kell tekinteni, míg a negatív eredménnyel rendelkező terhes nőket nem.

Ez a második csoport tünetmentes és tünetmentes kategóriába sorolható. A harmadik csoportba azok a normál gyermekek lesznek, akik olyan anyáktól születtek, akiknél nincs zika, és negatív IgG és IgM igazolódott. Minden gyermeket születésétől három évig követnek.

Az elemzendő eredmények A fő kimenetel a mikrokefália és/vagy a fejlődés késése lesz a Bayley Score 3. kiadás használatával 12, 18 és 24-36 hónapos korban.

A másodlagos vizsgálati eredmények a következők lesznek: terhesség ultrahangos állapota, méhlepénysérülések, szem-, hallás-, szív-, tápláltsági állapot és idegrendszeri fejlődési változások a születéstől három éves korig, terhes nők halála, abortusz, magzati halálozás és halálozás a terhesség alatt. életének első három évében.

Adatgyűjtés:

A terhes nők bevonására a vizsgálat első 24 hónapjában kerül sor. Az eredmények azonosítása érdekében minden gyermeket születésétől a három éves kronológiai életkor betöltéséig követnek. Az adatgyűjtés teljes vizsgálati ideje 5 év lesz. A vizsgálat 2016. január és 2022. március között zajlik.

Az adatokat egészségügyi szakemberek gyűjtik majd, akik kapcsolatban állnak az egészségügyi szolgáltatásokkal, és segítséget nyújtanak a vizsgált populációnak.

A terhességre, a születésre és az élet első három évére vonatkozó adatokat minden nővel egy kérdőív segítségével, a találkozó utáni interjúból nyerik. Ezen túlmenően az iratok adatait az erre a célra készített űrlapokon gyűjtik.

Az adatgyűjtési űrlapot (CRF/DCF) minden dimenziójában elkészítjük és validáljuk a szolgáltatások között. POP-okat készítenek a vizsgálat folyamatábrájához, valamint minden egyes eljáráshoz és gondozási szinthez.

• Társadalmi-gazdasági jellemzők (iskolai végzettség, egy főre jutó családi jövedelem, lakáskörülmények, higiénia és szemétszállítás); egészségügyi állapotok (társbetegségek).
• A ZIKAV-nak való kitettség története: rokonok, szomszédok és munkatársak azonosítása Zika-val

A vizsgált populáció nyomon követése

A terhes nők nyomon követése:

A vizsgálatba bevont terhes nőket a Fernandes Figueira National Brazilian Institute for Women and Children Egészségügyi Intézet prenatális klinikáján követik nyomon.

A várandós nők vizsgálatba vétele után havonta konzultációra kerül sor, és a vizsgálatokat az alábbi protokoll szerint végezzük:

• Magzati ultrahang minden trimeszterben
• Zika, dengue, chikungunya, CMV, toxoplazmózis és rubeola szerológiai vizsgálatok minden trimeszterben
• PCR a Zika-vírusra, ha tünetekkel küzdő terhes nő
• Szülés előtti vizsgálatok a Stork Network ajánlása szerint a brazil egészségügyi minisztertől
• Szülés előtti vizsgálatok a Brazilian Stork Network ajánlása szerint A magzatvíz gyűjthető, ha azt a veleszületett rendellenességek jelenléte jelzi.

Doppler:

A köldökzsinórt beszondázzák, hogy megkapják a köldökartéria szonogramját, és így értékeljék a pulzalitási indexet (PI), az ellenállási indexet (RI) és a szisztolés csúcssebességet (PSV).

Vírus kimutatása szérumban és más humán váladékban A vírus kimutatására betegeknél az RTP-pathogen (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Németország) kit segítségével szérumból és/vagy vizeletből (200 ml) vonják ki az RNS-t a gyártó utasításai szerint. Az izolált RNS templátként szolgál a valós idejű /RT-PCR-reakciókban, amint azt Lanciotti et al., 2008 és Faye és mtsai, 2013 leírták.

Vírus kimutatása szérumban és más emberi váladékban A genomi szekvenáláshoz a vírusgenom specifikus régióit RT-PCR módszerrel amplifikálják. Az így kapott termékeket agaróz gélelektroforézissel tisztítjuk, majd a QIAquick Gel Extraction (Qiagen) készlettel extraháljuk a gélből. Az extrahálás után az anyagot agarózgélben mennyiségileg meghatározzák a sávintenzitások összehasonlításával, a Low DNA Mass Ladder (Life Technologies) szabvány alkalmazásával. A szekvenáláshoz szükséges összeget a Fiocruz szekvenáló platformra továbbítjuk. A sorozatok manuálisan szerkeszthetők a Bioedit segítségével (v. 7.0.5.3) program, és a filogenetikai elemzéseket a MEGA (v. 5:05) program.

A méhlepény analízise és immunhisztokémia A friss méhlepényeket a Patológiai Anatómiai és Citopatológiai Osztályra (DAPC/DPAC) továbbítják, ahol 48 óráig hűtőszekrényben tárolják. Leírják, lemérik és lefényképezik őket a placenta elemzési rutinjának megfelelően. A korionlemez, a zsinór és a membránok töredékeit eltávolítják és folyékony nitrogénben lefagyasztják. A placenta lemez (öt terület), a zsinór (legalább két terület) és a chorion (egy fragmentum) rögzítve lesz pufferolt formalinban, maximális idő: 30 óra. Ezután szövettani feldolgozás céljából hasítják őket, és paraffinba ágyazzák.

A méhlepénysejtek, valamint az anyai és köldökzsinórvér, valamint a gyermek szájüregi tamponok fenotípusos jellemzése áramlási citometriával A placenta fragmentumokat steril DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [USA]) táptalajban (4 °C) kell összegyűjteni, majd lehasítani. több töredékre (vastagság: 1-2 mm). Hasítás után DMEM-ben mossuk, és kollagenáz 1A (Sigma;_) (300 U/mg; 1% DMEM) enzimben disszociációs ciklusoknak vetjük alá. A disszociáció 6-8 ciklus alatt megy végbe (enyhe keverés; 37 °C, mindegyik 10 perc). Az így kapott sejtszuszpenziót centrifugáljuk (1000 rpm; 4 °C; 10 perc), és a pelletet DMEM-be helyezzük / szuszpendáljuk magzati borjúszérummal (FCS; 10%; Sigma; _; 4 °C) az /inaktiváláshoz / gátolják a kollagenáz enzimet /hatást /aktivitást?. A disszociált anyagot [majd] kiszűrjük /in /át?a?a membrán ([pórusátmérő:] 70 mm). Ezután a sejteket egy Neubauer-kamrában megszámlálják a következő eljárásokhoz való felhasználáshoz. Az anyai és a köldökzsinórvért /egy vérben /egy megfelelő csőben gyűjtik, amely antikoagulánsként EDTA-t tartalmaz. A szérumot a vírus kimutatására használják, és a leukocita sejteket a vörösvértestek lízise után megjelölik.\

Magzatok és halvaszülöttek boncolása A ZIKAV fertőzés következtében magzatok és halvaszületések agyában és egyéb szerveiben kórszövettani és immunhisztokémiai vizsgálatokat és képalkotó morfogenezis vizsgálatokat végeznek. A szokásos paraffinos szövettani feldolgozás mellett a többi szervet lefagyasztják, és genetikai anyag extrakciójának és vírus RNS vizsgálatának vetik alá. A szemgolyót is elemzik a lehetséges szemelváltozások értékelése érdekében.

Újszülöttek nyomon követése:

Az újszülötteket 3 éves korukig követik az IFF ambulanciáján, melynek rutinja az első évben legalább 6, a második és harmadik évben évente 4 vizit. Multidiszciplináris járóbeteg-klinika kerül kialakításra mind a Gyermekfertőző Betegségek Osztályán, mind a Gyermek Ambulancián, hogy nyomon kövesse a ZIKA vírussal való vertikális expozíciós esélyekkel rendelkező gyermekek csoportját. A járóbeteg-klinikán egészségügyi személyzet, valamint fizikoterápia, fonoaudiológia, pszichológia és szociális szolgálat szakemberei lesznek. Az orvosi csapat feladata lesz a betegek nyomon követése, együttműködve olyan szakterületekkel, mint a neurológia, a gyermekkardiológia és a szemészet, valamint az orvosgenetikai szolgálat. Amikor csak szükséges, ezeket a betegeket a diagnózis felállítása vagy a kezdeti megközelítés - {az eset}] felvétele a DIPe osztályon történik.

A vírusfertőzésnek kitett vagy mikrokefáliában szenvedő betegek kezdeti értékelése a következő vizsgálatokból és/vagy értékelésekből áll: neurológiai, szemészeti, hallás, szükség esetén EEG, EKG, köldökzsinórvér RT-PCR-hez és IgM-hez. Az újszülött antropometriai adatai és fizikális vizsgálata, hangsúlyt fektetve a fejkörfogat pontos mérésére, referenciaként az Intergrowth Curve (2014) felhasználásával, a terhességi kor és a beteg neme szerint. A Genetics által végzett értékelés a diszmorf jellemzők vagy veleszületett rendellenességek kimutatására, amelyek veszélyeztethetik / befolyásolhatják más szerveket.

Képalkotó vizsgálatok:

1. transzfontanelle sonography (USTF), mint első választás
2. koponya tomográfia (CT) kontraszt nélkül, ha a TF technikailag nem lehetséges
3. Hasi ultrahang
4. Echokardiogram
5. Agyi mágneses rezonancia képalkotás, ha szükséges. g) Újszülöttek hallásszűrése (TAN):

1. Kiváltott optoakusztikus emisszió (EOAE); 24-48 óra élet 2. Az agytörzs hallásból kiváltott potenciálja (PEATE/ABR): akár 1 hónapos életkor is mikrokefáliás gyermekeknél. Meghibásodás esetén 30 napon belül meg kell ismételni a vizsgálatot. Az újratesztelés sikertelensége esetén azonnal továbbítsa [az NB]-t [a _] címre.

h) Szemészeti újszülöttkori szűrés (TON):

1. A retina vörös tükröződésének vizsgálata és tesztelése.
2. Eye Fund vizsgálat (fundoszkópia)
3. Dokumentáció RetCam segítségével

A további konzultációk során a klinikai nyomon követés, a PC mérés, a fejlődés értékelése (beleértve a korai stimulációt is) fizikoterápiával, valamint a morbiditás és mortalitás értékelése megmarad. Az első életévben a PEATE-t háromhavonta végezzük. Az ezt követő klinikai látogatások 6 hónapos korig havonta, 6-12 hónapos időszakban kéthavonta, [életkor] három évig háromhavonta lesznek. A szemészeti értékelést (fundoszkópos vizsgálatot) minden visszaküldéskor meg kell tartani.

A neurológiai nyomon követés a beteg kezdeti állapotától függ. A mikrokefáliában nem szenvedő betegeket születéskor, 30 nap, valamint 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 és 36 hónap után értékelik. A mikrokefáliás betegeket születéskor, 30 naponként és 2-3 havonta, vagy szükség esetén gyakrabban vizsgálják.

A mozgásfejlődés értékelését a Dubowitz-vizsgálat (az első 72 órában), az Alberta Infant Motor Scale (AIMS; háromhavonta, amíg a gyermek el nem sétál vagy a 18 hónapos élete befejeződik) és a Bayley Test-3. kiadás 12 évesen, 18 és 12-36 hónapos kor között.

A nyelvi fejlődés értékelésére 12, 24 és 36 hónapos korban kerül sor, tekintettel az idegrendszeri fejlődésre, a kognitív fejlődésre és a nyelvi készségekre gyakorolt ​​lehetséges hatásokra.