Vertikale Exposition gegenüber dem Zika-Virus und seine Folgen für die kindliche Neuroentwicklung (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

Das Hauptziel der Studie ist es, den natürlichen Verlauf der vertikalen ZIKV-Übertragung von der Schwangerschaft bis zum Ende des dritten Lebensjahres und das Vorhandensein von Risikofaktoren im Zusammenhang mit dem Auftreten klinischer und neurologischer Störungen, insbesondere der Mikrozephalie, zu beurteilen.

Es wird eine Längsschnittstudie von der Schwangerschaft bis zum Ende des dritten Lebensjahres durchgeführt, in der die ZIKV-Infektion die Hauptexposition darstellt.

Die Stichprobengröße beträgt 500 Kinder, die dem Zika-Virus ausgesetzt sind. Die Stichprobengröße wurde für seltene Ereignisse auf der Grundlage der üblichen Mikrozephalie-Prävalenz in Brasilien (2:10.000) berechnet. und erwarteter Anstieg der Zahl der Fälle bei schwangeren Frauen, die ZIKAV ausgesetzt waren.

Die Studie wird am Fernandes Figueira National Institute for Health of Women and Children (IFF) durchgeführt. Die schwangeren Frauen werden in der Schwangerenklinik des IFF und in den Abteilungen für Familiengesundheitsstrategie des Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF) ausgewählt, die beide von FioCruz/RJ stammen. Wir werden auch schwangere Frauen aus der klinischen Familie von SMS Rio de Janeiro rekrutieren.

Einschlusskriterien Die Studienpopulation besteht aus schwangeren Frauen, die Symptome aufweisen, die mit einer ZIKAV-Infektion vereinbar sind, mit Hautausschlag, Arthralgie-assoziiertem Fieber, Myalgie, nicht-eitriger Konjunktivitis oder Kopfschmerzen und asymptomatischen schwangeren Frauen, die gleichzeitig mit der Möglichkeit einer Exposition identifiziert wurden . Wir werden Patienten mit RT-PCR-positiv einschließen.

Alle Schwangeren, die sich in der pränatalen Nachsorge bei IFF und CSGSF befinden, kommen unabhängig vom Gestationsalter als zu Beginn nicht exponiert infrage.

Ausschlusskriterien Schwangere Frauen mit Chromosomenanomalien, die während des fötalen Lebens oder der Geburt festgestellt wurden, werden ausgeschlossen.

Definition der Exposition Da bekannt ist, dass etwa 80 % der ZIKAV-Infektionen asymptomatisch verlaufen, wird die Exposition durch die Positivität in diagnostischen Tests (PCR oder serologische Tests) bestätigt. In Anbetracht der zukünftigen Verfügbarkeit serologischer Tests werden einige Strategien zur Definition von Expositionsgruppen verwendet, da bisher nur der PCR-Test verfügbar ist, der nur in der akuten Phase der Krankheit positiv bleibt.

Wie oben beschrieben, werden die symptomatischen Frauen zur infektionsdiagnostischen Bestätigung durch RT-PCR und serologischen Tests auf Dengue, Chikcungunha, CMV, Toxoplasmose und Röteln überwiesen.

Frauen mit und ohne Symptome wird in den drei Trimestern der Schwangerschaft und bei der Geburt Blut für serologische Tests entnommen. Blutproben werden in einem Biolager für serologische ZIKA-Tests aufbewahrt, wenn spezifische serologische Tests verfügbar sind. Diese sequenziellen Proben werden auch verwendet, um serologische Tests zu validieren, die sich in der Entwicklungsphase befinden.

Die zu vergleichenden Expositionsgruppen werden anhand der Ergebnisse der serologischen Untersuchungen zusammengestellt. Die asymptomatischen Personen, deren Blutproben in Zukunft auf das Vorhandensein einer Zika-Infektion hinweisen, werden in die Gruppe der Exponierten migrieren.

Die schwangeren Frauen in der Kohorte, die positive Ergebnisse für spezifische Tests (PCR in der akuten Phase und serologische Tests später) aufweisen, werden als einer Infektion ausgesetzt betrachtet, während schwangere Frauen mit negativen Ergebnissen als nicht exponiert betrachtet werden.

Diese zweite Gruppe kann als asymptomatisch und symptomatisch kategorisiert werden. Die dritte Gruppe sind die normalen Kinder, die von Müttern ohne Zika geboren wurden, die durch negatives IgG und IgM nachgewiesen wurden. Jedes Kind wird ab der Geburt drei Jahre lang beobachtet.

Zu analysierende Ergebnisse Das Hauptergebnis wird Mikrozephalie und/oder Entwicklungsverzögerung unter Verwendung des Bayley Score 3rd Edition im Alter von 12, 18 und 24-36 Monaten sein.

Die sekundären Studienergebnisse sind wie folgt: Schwangerschafts-Ultraschallstatus, Plazentaverletzungen, Augen-, Hör-, Herz-, Ernährungsstatus von Kindern und neurologische Entwicklungsveränderungen von der Geburt bis zum Alter von drei Jahren, Tod bei schwangeren Frauen, Abtreibung, fötaler Tod und Tod während der Schwangerschaft ersten drei Lebensjahre.

Datensammlung:

Der Einschluss schwangerer Frauen erfolgt in den ersten 24 Monaten der Studie. Um die Ergebnisse zu ermitteln, wird jedes Kind von der Geburt bis zur Vollendung des chronologischen Alters von drei Jahren beobachtet. Die gesamte Studiendauer für die Datenerhebung beträgt 5 Jahre. Die Studie wird im Zeitraum Januar 2016 - März 2022 durchgeführt.

Die Daten werden von Angehörigen der Gesundheitsberufe erhoben, die mit Gesundheitsdiensten verbunden sind und die Studienpopulation unterstützen.

Daten zu Schwangerschaft, Geburt und den ersten drei Lebensjahren werden aus einem Interview mit jeder Frau anhand eines Fragebogens nach Terminvereinbarung erhoben. Darüber hinaus werden Daten für Aufzeichnungen in dafür vorbereiteten Formularen erhoben.

Das Datenerfassungsformular (CRF/DCF) wird in allen seinen Dimensionen unter den Diensten erstellt und validiert. POPs für das Studienflussdiagramm und für jedes Verfahren und jede Pflegestufe werden vorbereitet.

• sozioökonomische Merkmale (Bildung, Familieneinkommen pro Kopf, Wohnverhältnisse, sanitäre Einrichtungen und Müllabfuhr); Gesundheitszustände (Komorbiditäten).
• Geschichte der Exposition gegenüber ZIKAV: Identifizierung von Verwandten, Nachbarn und Arbeitskollegen mit Zika

Follow-up der Studienpopulation

Nachsorge der Schwangeren:

Die an der Studie teilnehmenden schwangeren Frauen werden in der Pränatalklinik des Nationalen Brasilianischen Instituts für Gesundheit von Frauen und Kindern in Fernandes Figueira nachbeobachtet.

Nach Aufnahme der Schwangeren in die Studie finden monatliche Konsultationen und Untersuchungen nach folgendem Protokoll statt:

• Fetaler Ultraschall in jedem Trimester
• Serologische Untersuchungen auf Zika, Dengue, Chikungunya, CMV, Toxoplasmose und Röteln in jedem Trimester
• PCR für Zika-Virus bei symptomatischer schwangerer Frau
• Vorgeburtliche Untersuchungen wie vom Stork Network des brasilianischen Gesundheitsministeriums empfohlen
• Pränatale Untersuchungen wie vom Brasilianischen Storchennetzwerk empfohlen Das Fruchtwasser kann gesammelt werden, wenn es durch das Vorliegen von assoziierten angeborenen Anomalien angezeigt ist.

Doppler:

Die Nabelschnur wird beschallt, um ein Sonogramm der Nabelarterie zu erhalten und so den Pulsatilitätsindex (PI), den Widerstandsindex (RI) und die systolische Spitzengeschwindigkeit (PSV) zu beurteilen.

Virusnachweis in Serum und anderen menschlichen Sekreten Zum Nachweis von Viren in Patienten wird RNA aus Serum und/oder Urin (200 ml) unter Verwendung des RTP-Pathogen-Kits (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Isolierte RNA dient als Matrize in Echtzeit-/RT-PCR-Reaktionen, wie beschrieben von: Lanciotti et al., 2008 e Faye et al., 2013.

Virusnachweis in Serum und anderen menschlichen Sekreten Für die Genomsequenzierung werden bestimmte Regionen des Virusgenoms mit der RT-PCR-Methode amplifiziert. Die so erhaltenen Produkte werden durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und dann mit dem QIAquick Gelextraktionskit (Qiagen) aus dem Gel extrahiert. Nach der Extraktion wird das Material in Agarosegel durch Vergleich zwischen Bandenintensitäten unter Verwendung des Low DNA Mass Ladder (Life Technologies)-Standards quantifiziert. Die für die Sequenzierung benötigte Menge wird an die Sequenzierungsplattform Fiocruz weitergeleitet. Die Sequenzen werden manuell mit dem Bioedit (v. 7.0.5.3) Programm, und die phylogenetischen Analysen werden mit dem MEGA (v. 5:05) Programm.

Analyse der Plazenta und Immunhistochemie Die frischen Plazentas werden an die Abteilung für Pathologische Anatomie und Zytopathologie (DAPC/DPAC) weitergeleitet, wo sie bis zu 48 h im Kühlschrank aufbewahrt werden. Sie werden gemäß der Routine zur Plazentaanalyse beschrieben, gewogen und fotografiert. Fragmente der Chorionplatte, der Schnur und der Membranen werden entfernt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Plazentaplatte (fünf Bereiche), Nabelschnur (mindestens zwei Bereiche) und Chorion (ein Fragment) werden in gepuffertem Formalin fixiert (maximale Zeit: 30 h). Sie werden dann für die histologische Verarbeitung gespalten und in Paraffin eingebettet.

Phänotypische Charakterisierung von Plazentazellen und mütterlichem und Nabelschnurblut sowie Mundabstrich von Kindern durch Durchflusszytometrie Plazentafragmente werden gesammelt und in sterilem DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [USA]) Kulturmedium (4 °C) aufbewahrt und gespalten in mehrere Fragmente (Dicke: 1-2 mm). Nach der Spaltung werden sie in DMEM gewaschen und Dissoziationszyklen im Enzym Collagenase 1A (Sigma; _) (300 U/mg; in 1 % DMEM) unterzogen. Die Dissoziation erfolgt in 6–8 Zyklen (leichte Bewegung; 37 °C, jeweils 10 min). Die so erhaltene Zellsuspension wird zentrifugiert (1000 rpm; 4 °C; 10 min) und das Pellet wird in DMEM mit fötalem Kälberserum (FCS; 10 %; Sigma; _; 4 °C) zum /inaktivieren / hemmen das Kollagenase-Enzym /Aktion /Aktivität?. Das dissoziierte Material wird [dann] gefiltert /in /durch?a Membran ([Porendurchmesser:] 70 mm). Dann werden die Zellen in einer Neubauer-Kammer zur Verwendung in den folgenden Verfahren gezählt. Das mütterliche Blut und das Nabelschnurblut werden in /einem Blut /einem geeigneten Röhrchen mit EDTA als Antikoagulans gesammelt. Das Serum wird zum Virusnachweis verwendet und die Leukozyten werden nach der Lyse der roten Blutkörperchen markiert.\

Nekropsie von Föten und Totgeburten Histopathologische und immunhistochemische Untersuchungen und bildgebende Morphogenesestudien werden im Gehirn und anderen Organen von Föten und Totgeburten / als Folge einer ZIKAV-Infektion durchgeführt. Neben der üblichen histologischen Aufarbeitung in Paraffin werden die anderen Organe eingefroren und der Gewinnung von genetischem Material und der Untersuchung viraler RNA unterzogen. Der Augapfel wird ebenfalls analysiert, um mögliche Augenveränderungen zu beurteilen.

Nachsorge von Neugeborenen:

Neugeborene werden bis zum Alter von 3 Jahren in der Ambulanz des IFF betreut, deren Routine mindestens 6 Besuche im ersten Jahr, 4 Besuche/Jahr im zweiten und dritten Jahr umfasst. Sowohl in der Abteilung für Infektionskrankheiten in der Pädiatrie als auch in der pädiatrischen Ambulanz wird eine multidisziplinäre Ambulanz eingerichtet, um die Kohorte von Kindern mit der Möglichkeit einer vertikalen Exposition gegenüber dem ZIKA-Virus zu verfolgen. Die Ambulanz wird über medizinisches Personal und Fachleute in den Bereichen Physiotherapie, Phonoaudiologie, Psychologie und Sozialdienste verfügen. Das medizinische Team wird in Zusammenarbeit mit Fachgebieten wie Neurologie, pädiatrischer Kardiologie und Augenheilkunde sowie dem Dienst für medizinische Genetik für die Nachsorge der Patienten verantwortlich sein. Die Aufnahme dieser Patienten zur Diagnosestellung bzw. Erstansprache erfolgt im Bedarfsfall auf der DIPe-Station.

Die anfängliche Bewertung, wie sie für Patienten empfohlen wird, die entweder bekanntermaßen dem Virus ausgesetzt sind oder an Mikrozephalie leiden, besteht aus den folgenden Untersuchungen und/oder Bewertungen: neurologische, okulare, Gehör, EEG, falls erforderlich, EKG, Nabelschnurblut für RT-PCR und IgM. Anthropometrische Daten und körperliche Untersuchung des Neugeborenen, mit Schwerpunkt auf präziser Messung des Kopfumfangs unter Verwendung der Intergrowth Curve (2014) als Referenz, nach Gestationsalter und Patientengeschlecht. Bewertung durch die Genetik, um dysmorphe Merkmale oder angeborene Anomalien zu erkennen, die andere Organe beeinträchtigen/beeinflussen können.

Bildgebende Untersuchungen:

1. transfontanelle Sonographie (USTF), als erste Wahl
2. Schädeltomographie (CT) ohne Kontrastmittel, wenn TF technisch nicht möglich ist
3. Bauch-Ultraschall
4. Echokardiogramm
5. Magnetresonanztomographie des Gehirns, wenn angezeigt. g) Neugeborenen-Hörscreening (TAN):

1. Evozierte optoakustische Emissionen (EOAE); 24-48 h des Lebens 2. Akustisch evoziertes Potenzial des Hirnstamms (PEATE/ABR): bis zu 1 Lebensmonat bei Kindern mit Mikrozephalie. Im Falle eines Nichtbestehens muss innerhalb von 30 Tagen ein erneuter Test durchgeführt werden. Im Falle eines erneuten Testfehlers, leiten Sie [die NB] unverzüglich [an _] weiter.

h) Okulares Neugeborenen-Screening (TON):

1. Inspektion und Prüfung der retinalen Rotreflexion.
2. Augenfunduntersuchung (Fundoskopie)
3. Dokumentation mit RetCam

In den anschließenden Konsultationen werden die klinische Nachsorge, die PC-Messung, die Entwicklungsbewertung (einschließlich früher Stimulation) durch physikalische Therapie sowie die Morbiditäts- und Mortalitätsbewertung beibehalten. Im ersten Lebensjahr wird PEATE alle drei Monate durchgeführt. Die anschließenden Klinikbesuche erfolgen bis zum 6. Lebensmonat monatlich, im Zeitraum 6-12 Monate alle 2 Monate und bis zum 3. Lebensjahr alle 3 Monate. Die ophthalmologische Untersuchung (funduskopische Untersuchung) findet bei jeder Rückkehr statt.

Die neurologische Nachsorge hängt vom Ausgangszustand des Patienten ab. Patienten ohne Mikrozephalie werden bei der Geburt, nach 30 Tagen und nach 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 und 36 Monaten untersucht. Patienten mit Mikrozephalie werden bei der Geburt, nach 30 Tagen und alle 2 oder 3 Monate oder bei Bedarf häufiger untersucht.

Die Bewertung der motorischen Entwicklung erfolgt durch die Dubowitz-Untersuchung (in den ersten 72 h), die Alberta Infant Motor Scale (AIMS; alle drei Monate, bis das Kind läuft oder die 18 Lebensmonate vollendet) und den Bayley-Test – 3. Ausgabe bei 12, 18 und zwischen 12-36 Monate alt.

Die Beurteilung der Sprachentwicklung erfolgt nach 12, 24 und 36 Monaten im Hinblick auf mögliche Auswirkungen auf die neurologische Entwicklung, die kognitive Entwicklung und die Sprachfähigkeit.