Esposizione verticale al virus Zika e alle sue conseguenze per il neurosviluppo infantile (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

L'obiettivo principale dello studio è valutare la storia naturale della trasmissione verticale di ZIKV dalla gravidanza alla fine del terzo anno di vita e l'esistenza di fattori di rischio associati all'incidenza di disturbi clinici e neurologici, in particolare la microcefalia.

Verrà condotto uno studio longitudinale dalla gestazione fino alla fine del terzo anno di vita, durante il quale l'infezione da ZIKV sarà l'esposizione principale.

La dimensione del campione sarà di 500 bambini esposti al virus zika. La dimensione del campione è stata calcolata per eventi rari sulla base della consueta prevalenza di microcefalia in Brasile (2:10.000) e previsto aumento del numero di casi tra le donne in gravidanza esposte a ZIKAV.

Lo studio sarà condotto presso l'Istituto nazionale Fernandes Figueira per la salute delle donne e dei bambini (IFF). Le donne incinte saranno selezionate nella clinica di assistenza prenatale dell'IFF e nelle unità di Strategia per la salute familiare, presso il Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF), entrambe di FioCruz/RJ. Recluteremo anche una donna incinta dalla famiglia clinica di SMS Rio de Janeiro.

Criteri di inclusione La popolazione dello studio sarà composta da donne in gravidanza che presentino sintomi compatibili con infezione da ZIKAV, con rash cutaneo, febbre associata ad artralgia, mialgia, congiuntivite non purulenta o cefalea e donne in gravidanza asintomatiche identificate contemporaneamente alla possibilità di esposizione . Includeremo pazienti con RT-PCR positivi.

Tutte le gestanti che sono in follow-up prenatale presso IFF e CSGSF, indipendentemente dall'età gestazionale, sono idonee come non esposte all'inizio.

Criteri di esclusione Saranno escluse le donne in gravidanza con anomalie cromosomiche rilevate durante la vita fetale o il parto.

Definizione di esposizione Sapendo che circa l'80% delle infezioni da ZIKAV sono asintomatiche, l'esposizione sarà confermata dalla positività ai test diagnostici (PCR o test sierologici). Considerata la futura disponibilità di test sierologici, verranno utilizzate alcune strategie per definire i gruppi di esposizione perché finora è disponibile solo il test PCR, che rimane positivo solo nella fase acuta della malattia.

Come descritto sopra, le donne sintomatiche saranno inviate per la conferma diagnostica dell'infezione mediante RT-PCR e test sierologici per dengue, chikcungunha, CMV, toxoplasmosi e rosolia.

Le donne con e senza sintomi verranno sottoposte a prelievo di sangue per i test sierologici nei tre trimestri di gravidanza e alla nascita. I campioni di sangue saranno conservati in un biorepository per i test sierologici ZIKA quando saranno disponibili test sierologici specifici. Questi campioni sequenziali saranno utilizzati anche per convalidare i test sierologici che sono in fase di sviluppo.

I gruppi di esposizione da confrontare saranno composti in base ai risultati dei test sierologici. Gli individui asintomatici i cui campioni di sangue indicano la presenza di infezione da Zika in futuro migreranno nel gruppo di quelli esposti.

Le donne gravide della coorte che presenteranno esito positivo a test specifici (PCR in fase acuta e test sierologici successivi) saranno considerate esposte all'infezione mentre le donne gravide con esito negativo saranno considerate non esposte.

Questo secondo gruppo può essere classificato come asintomatico e sintomatico. Il terzo gruppo saranno i bambini normali nati da madri senza zika risultate IgG e IgM negative. Ogni bambino sarà seguito per tre anni dalla nascita in poi.

Risultati da analizzare L'esito principale sarà la microcefalia e/o il ritardo nello sviluppo utilizzando il punteggio Bayley 3a edizione a 12, 18 e 24-36 mesi di età.

Gli esiti secondari dello studio saranno i seguenti: stato ecografico della gravidanza, lesioni della placenta, stato oculare, uditivo, cardiaco, nutrizionale dei bambini e cambiamenti dello sviluppo neurologico dalla nascita ai tre anni, morte nelle donne in gravidanza, aborto, morte fetale e morte durante il primi tre anni di vita.

Raccolta dati:

L'inclusione delle donne in gravidanza avverrà nei primi 24 mesi dello studio. Per identificare gli esiti, ogni bambino sarà seguito dalla nascita fino al compimento dei tre anni di età cronologica. Il periodo di studio totale per la raccolta dei dati sarà di 5 anni. Lo studio sarà condotto nel periodo gennaio 2016 - marzo 2022.

I dati saranno raccolti da operatori sanitari che sono collegati ai servizi sanitari e forniscono assistenza alla popolazione dello studio.

I dati sulla gestazione, sulla nascita e sui primi tre anni di vita saranno ottenuti da un colloquio con ciascuna donna utilizzando un questionario previo appuntamento. Inoltre, i dati per le registrazioni saranno raccolti in moduli predisposti a tale scopo.

La scheda raccolta dati (CRF/DCF) sarà costruita e validata in tutte le sue dimensioni tra i servizi. Saranno preparati i POP per il diagramma di flusso dello studio e per ogni procedura e livello di cura.

• Caratteristiche socioeconomiche (istruzione, reddito familiare pro capite, condizioni abitative, servizi igienico-sanitari e raccolta dei rifiuti); condizioni di salute (comorbilità).
• Storia dell'esposizione a ZIKAV: identificazione di parenti, vicini e colleghi di lavoro con Zika

Follow-up della popolazione in studio

Follow up delle gestanti:

Le donne incinte incluse nello studio saranno seguite nella clinica prenatale, presso l'Istituto nazionale brasiliano Fernandes Figueira per la salute delle donne e dei bambini.

Dopo l'inclusione delle donne in gravidanza nello studio, le consultazioni avverranno mensilmente e gli esami verranno eseguiti secondo il seguente protocollo:

• Ecografia fetale ad ogni trimestre
• Esami sierologici per Zika, dengue, chikungunya, CMV, toxoplasmosi e rosolia ogni trimestre
• PCR per virus Zika se donna incinta sintomatica
• Esami prenatali raccomandati dalla Rete Stork del Ministro della Salute brasiliano
• Esami prenatali come raccomandato dalla Rete Cicogna Brasiliana Il liquido amniotico può essere prelevato se indicato dalla presenza di anomalie congenite associate.

Doppler:

Il cordone ombelicale verrà insonorato per ottenere un sonogramma dell'arteria ombelicale e quindi valutare l'indice di pulsatilità (PI), l'indice di resistenza (RI) e la velocità sistolica di picco (PSV).

Rilevamento del virus nel siero e in altre secrezioni umane Per il rilevamento del virus nei pazienti, l'RNA viene estratto dal siero e/o dall'urina (200 ml) utilizzando il kit RTP Pathogen (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Germania) secondo le istruzioni del produttore. L'RNA isolato funge da template nelle reazioni in real-time /RT-PCR come descritto da: Lanciotti et al., 2008 e Faye et al., 2013.

Rilevazione del virus nel siero e in altre secrezioni umane Per il sequenziamento genomico, regioni specifiche del genoma del virus saranno amplificate mediante il metodo RT-PCR. I prodotti così ottenuti saranno purificati mediante elettroforesi su gel di agarosio e quindi estratti dal gel utilizzando il kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Dopo l'estrazione, il materiale sarà quantificato in gel di agarosio per confronto tra intensità di bande utilizzando lo standard Low DNA Mass Ladder (Life Technologies). L'importo necessario per il sequenziamento verrà inoltrato alla piattaforma di sequenziamento Fiocruz. Le sequenze verranno modificate manualmente utilizzando il Bioedit (v. 7.0.5.3) e le analisi filogenetiche saranno effettuate utilizzando il MEGA (v. 5:05) programma.

Analisi della placenta e immunoistochimica Le placente fresche saranno inviate al Dipartimento di Anatomia Patologica e Citopatologia (DAPC/DPAC) dove saranno conservate in frigorifero per un massimo di 48 ore. Vengono descritti, pesati e fotografati secondo la routine per l'analisi della placenta. I frammenti della piastra corionica, del cordone e delle membrane saranno rimossi e congelati in azoto liquido. La placca placentare (cinque aree), il cordone (almeno due aree) e il corion (un frammento) saranno fissati in formalina tamponata (tempo massimo: 30 h). Saranno quindi scissi per l'elaborazione istologica e inclusi in paraffina.

Caratterizzazione fenotipica delle cellule placentari e del sangue materno e del cordone ombelicale e tampone orale infantile mediante citometria a flusso I frammenti placentari saranno raccolti e mantenuti in terreno di coltura sterile DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [USA]) (4 °C) e scissi in più frammenti (spessore: 1-2 mm). Dopo la scissione, vengono lavate in DMEM e sottoposte a cicli di dissociazione nell'enzima collagenasi 1A (Sigma; _) (300 U/mg; in 1% DMEM). La dissociazione avverrà in 6-8 cicli (lieve agitazione; 37 °C, 10 min ciascuno). La sospensione cellulare così ottenuta sarà centrifugata (1000 rpm; 4 °C; 10 min) e il pellet sarà posto/sospeso in DMEM con siero fetale bovino (FCS; 10%; Sigma; _; 4 °C) per /inattivare/ inibire l'enzima collagenasi/azione/attività?. Il materiale dissociato sarà [quindi] filtrato /in /attraverso?a membrana ([diametro dei pori:] 70 mm). Quindi, le cellule saranno contate in una camera di Neubauer per l'uso nelle seguenti procedure. Il sangue materno e del cordone ombelicale sarà raccolto in/un sangue/un'apposita provetta contenente EDTA come anticoagulante. Il siero verrà utilizzato per il rilevamento virale e le cellule leucocitarie verranno contrassegnate dopo la lisi dei globuli rossi.\

Necropsia di feti e nati morti Gli esami istopatologici e immunoistochimici e lo studio della morfogenesi per immagini saranno eseguiti nel cervello e in altri organi da feti e nati morti / in conseguenza dell'infezione da ZIKAV. Oltre alla consueta elaborazione istologica in paraffina, gli altri organi saranno congelati e sottoposti ad estrazione di materiale genetico e ricerca di RNA virale. Verrà analizzato anche il bulbo oculare per valutare eventuali alterazioni oculari.

Follow-up dei neonati:

I neonati saranno seguiti fino ai 3 anni di età presso l'ambulatorio dell'IFF, la cui routine prevede almeno 6 visite nel primo anno, 4 visite/anno nel secondo e terzo anno. Un ambulatorio multidisciplinare sarà istituito sia nell'Unità di malattie infettive in pediatria che nell'ambulatorio pediatrico per seguire la coorte di bambini con possibilità di esposizione verticale al virus ZIKA. L'ambulatorio disporrà di personale medico e di professionisti nei settori della fisioterapia, della fonoaudiologia, della psicologia e dei servizi sociali. L'équipe medica si occuperà di seguire i pazienti, in collaborazione con specialità come neurologia, cardiologia pediatrica e oftalmologia, e servizio di genetica medica. Quando necessario, il ricovero di questi pazienti per stabilire [o] la diagnosi o l'approccio iniziale -{del caso} avverrà nel reparto DIPe.

La valutazione iniziale raccomandata per i pazienti noti per essere esposti al virus o con microcefalia consisterà nei seguenti esami e/o valutazioni: neurologico, oculare, uditivo, EEG se necessario, ECG, sangue cordonale per RT-PCR e IgM. Dati antropometrici ed esame fisico del neonato, con enfasi sulla misurazione precisa della circonferenza cranica utilizzando come riferimento l'Intergrowth Curve (2014), in base all'età gestazionale e al sesso del paziente. Valutazione da parte della Genetica per rilevare caratteristiche dismorfiche o anomalie congenite che possono compromettere/interessare altri organi.

Esami di imaging:

1. ecografia transfontanelle (USTF), come prima scelta
2. tomografia cranica (TC) senza mezzo di contrasto, se TF non è tecnicamente possibile
3. Ecografia addominale
4. Ecocardiogramma
5. Imaging a risonanza magnetica cerebrale, quando indicato. g) Screening dell'udito neonatale (TAN):

1. Emissioni optoacustiche evocate (EOAE); 24-48 ore di vita 2. Potenziale evocato uditivo del tronco cerebrale (PEATE/ABR): fino a 1 mese di vita nei bambini con microcefalia. In caso di fallimento, il test deve essere ripetuto entro 30 giorni. In caso di fallimento del nuovo test, inoltrare [l'NB] immediatamente [a _].

h) Screening oculare neonatale (TON):

1. Ispezione e test del riflesso rosso retinico.
2. Esame del fondo oculare (fondoscopia)
3. Documentazione con RetCam

Nelle consultazioni successive, verranno mantenuti il ​​follow-up clinico, la misurazione del PC, la valutazione dello sviluppo (inclusa la stimolazione precoce) mediante terapia fisica e la valutazione della morbilità e della mortalità. Nel primo anno di vita, PEATE verrà eseguito ogni tre mesi. Le successive visite ambulatoriali avverranno mensilmente fino a 6 mesi di età, ogni due mesi nel periodo 6-12 mesi, e ogni tre mesi fino a tre anni [di vita]. La valutazione oftalmologica (esame del fondo oculare) verrà effettuata ad ogni ritorno.

Il follow-up neurologico dipenderà dalle condizioni iniziali del paziente. I pazienti senza microcefalia saranno valutati alla nascita, 30 giorni e 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 e 36 mesi. I pazienti con microcefalia saranno valutati alla nascita, 30 giorni e ogni 2 o 3 mesi, o più frequentemente se necessario.

La valutazione dello sviluppo motorio sarà effettuata mediante l'esame Dubowitz (nelle prime 72 ore), l'Alberta Infant Motor Scale (AIMS; ogni tre mesi fino a quando il bambino cammina o completa i 18 mesi di vita) e il Bayley Test-3rd edition a 12, 18 e tra i 12 e i 36 mesi di età.

La valutazione dello sviluppo del linguaggio sarà eseguita a 12, 24 e 36 mesi, per quanto riguarda i possibili effetti sullo sviluppo neurologico, sullo sviluppo cognitivo e sulle abilità linguistiche.