Exposição vertical ao vírus Zika e suas consequências para o neurodesenvolvimento infantil (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

O objetivo principal do estudo é avaliar a história natural da transmissão vertical do ZIKV desde a gravidez até o final do terceiro ano de vida e a existência de fatores de risco associados à incidência de distúrbios clínicos e neurológicos, especialmente microcefalia.

Será realizado um estudo longitudinal desde a gestação até o final do terceiro ano de vida, durante o qual a infecção pelo ZIKV será a principal exposição.

O tamanho da amostra será de 500 crianças expostas ao zika vírus. O tamanho da amostra foi calculado para eventos raros com base na prevalência usual de microcefalia no Brasil (2:10.000) e aumento esperado no número de casos entre mulheres grávidas expostas ao ZIKAV.

O estudo será realizado no Instituto Nacional de Saúde da Mulher e da Criança (IFF) Fernandes Figueira. As gestantes serão selecionadas no ambulatório de pré-natal do IFF e nas unidades da Estratégia Saúde da Família, do Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF), ambos da FioCruz/RJ. Também recrutaremos gestantes da família clínica da SMS Rio de Janeiro.

Critérios de inclusão A população do estudo será composta por gestantes que apresentarem sintomas compatíveis com infecção pelo ZIKAV, com erupção cutânea, febre associada a artralgia, mialgia, conjuntivite não purulenta ou cefaléia e gestantes assintomáticas identificadas no mesmo momento de possibilidade de exposição . Incluiremos pacientes com RT-PCR positivo.

Todas as gestantes que estão em acompanhamento pré-natal no IFF e CSGSF, independentemente da idade gestacional, são elegíveis como não expostas no início.

Critérios de exclusão Serão excluídas gestantes com anomalias cromossômicas detectadas durante a vida fetal ou nascimento.

Definição de exposição Sabendo-se que cerca de 80% das infecções por ZIKAV são assintomáticas, a exposição será confirmada pela positividade em testes diagnósticos (PCR ou testes sorológicos). Considerando a disponibilidade futura de testes sorológicos, algumas estratégias serão utilizadas para definir os grupos de exposição, pois até o momento está disponível apenas o teste de PCR, que permanece positivo apenas na fase aguda da doença.

Conforme descrito acima, as mulheres sintomáticas serão encaminhadas para confirmação diagnóstica da infecção por RT-PCR e sorologia para dengue, chikcungunha, CMV, toxoplasmose e rubéola.

As mulheres com e sem sintomas terão seu sangue coletado para testes sorológicos nos três trimestres da gravidez e no nascimento. As amostras de sangue serão armazenadas em um biorrepositório para testes sorológicos de ZIKA quando testes sorológicos específicos estiverem disponíveis. Essas amostras sequenciais também serão utilizadas para validar os testes sorológicos que estão em fase de desenvolvimento.

Os grupos de exposição a serem comparados serão compostos com base nos resultados dos testes sorológicos. Os indivíduos assintomáticos cujas amostras de sangue indiquem a presença de infecção por Zika no futuro, migrarão para o grupo de expostos.

As gestantes da coorte que apresentarem resultados positivos para testes específicos (PCR na fase aguda e testes sorológicos posteriormente) serão consideradas expostas à infecção, enquanto as gestantes com resultados negativos serão consideradas não expostas.

Este segundo grupo pode ser classificado como assintomático e sintomático. O terceiro grupo será de crianças normais nascidas de mães sem zika comprovadas por IgG e IgM negativas. Cada criança será acompanhada por três anos a partir do nascimento.

Desfechos a serem analisados ​​O desfecho principal será microcefalia e/ou atraso no desenvolvimento pelo Bayley Score 3ª edição aos 12, 18 e 24-36 meses de idade.

Os desfechos do estudo secundário serão os seguintes: estado ultrassonográfico da gravidez, lesões placentárias, oculares, auditivas, cardíacas, estado nutricional de crianças e alterações do neurodesenvolvimento desde o nascimento até os três anos de idade, morte em gestantes, aborto, morte fetal e morte durante o três primeiros anos de vida.

Coleção de dados:

A inclusão das gestantes ocorrerá nos primeiros 24 meses do estudo. Para identificar os desfechos, cada criança será acompanhada desde o nascimento até completar três anos de idade cronológica. O período total do estudo para coleta de dados será de 5 anos. O estudo será realizado no período de janeiro de 2016 a março de 2022.

Os dados serão coletados por profissionais de saúde vinculados aos serviços de saúde e que prestam assistência à população do estudo.

Os dados sobre a gestação, nascimento e os primeiros três anos de vida serão obtidos a partir de uma entrevista com cada mulher por meio de um questionário após a consulta. Além disso, os dados para cadastro serão coletados em formulários elaborados para esse fim.

O formulário de coleta de dados (CRF/DCF) será construído e validado em todas as suas dimensões entre os serviços. Serão elaborados POPs para o fluxograma do estudo e para cada procedimento e nível de atendimento.

• Características socioeconômicas (escolaridade, renda familiar per capita, condições de moradia, saneamento e coleta de lixo); condições de saúde (comorbidades).
• Histórico de exposição ao ZIKAV: identificação de parentes, vizinhos e colegas de trabalho com Zika

Acompanhamento da população do estudo

Acompanhamento das gestantes:

As gestantes incluídas no estudo serão acompanhadas no ambulatório de pré-natal, no Instituto Nacional Brasileiro de Saúde da Mulher e da Criança Fernandes Figueira.

Após a inclusão das gestantes no estudo, as consultas ocorrerão mensalmente, e os exames serão realizados conforme o seguinte protocolo:

• Ultrassom fetal a cada trimestre
• Exames sorológicos para Zika, dengue, chikungunya, CMV, toxoplasmose e rubéola a cada trimestre
• PCR para vírus Zika se gestante sintomática
• Exames de pré-natal recomendados pela Rede Cegonha do Ministério da Saúde do Brasil
• Exames pré-natais recomendados pela Rede Cegonha Brasileira A coleta de líquido amniótico pode ser indicada pela presença de anomalias congênitas associadas.

Doppler:

O cordão umbilical será insonado para obter um ultrassom da artéria umbilical e, assim, avaliar o índice de pulsatilidade (PI), índice de resistência (IR) e pico de velocidade sistólica (PSV).

Detecção de vírus em soro e outras secreções humanas Para detecção de vírus em pacientes, o RNA é extraído do soro e/ou urina (200 ml) usando o kit RTP Pathogen (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA isolado serve como modelo em reações /RT-PCR em tempo real, conforme descrito por: Lanciotti et al., 2008 e Faye et al., 2013.

Detecção de vírus em soro e outras secreções humanas Para o sequenciamento genômico, regiões específicas do genoma do vírus serão amplificadas pelo método RT-PCR. Os produtos assim obtidos serão purificados por eletroforese em gel de agarose e posteriormente extraídos do gel utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Após a extração, o material será quantificado em gel de agarose por comparação entre as intensidades das bandas utilizando o padrão Low DNA Mass Ladder (Life Technologies). O valor necessário para o sequenciamento será encaminhado para a plataforma de sequenciamento da Fiocruz. As sequências serão editadas manualmente usando o Bioedit (v. 7.0.5.3), e as análises filogenéticas serão realizadas no programa MEGA (v. 5:05) programa.

Análise da placenta e imunohistoquímica As placentas frescas serão encaminhadas ao Departamento de Anatomia Patológica e Citopatologia (DAPC/DPAC) onde serão mantidas em geladeira por até 48 h. São descritos, pesados ​​e fotografados conforme rotina para análise de placenta. Fragmentos da placa coriônica, cordão e membranas serão removidos e congelados em nitrogênio líquido. A placa placentária (cinco áreas), cordão (pelo menos duas áreas) e córion (um fragmento) serão fixados em formol tamponado por tempo máximo: 30 h). Em seguida, serão clivados para processamento histológico e incluídos em parafina.

Caracterização fenotípica das células da placenta e sangue materno e de cordão umbilical e swab oral infantil por citometria de fluxo Fragmentos da placenta serão coletados e mantidos em meio de cultura DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [EUA]) estéril (4 °C) e clivados em vários fragmentos (espessura: 1-2 mm). Após a clivagem, são lavadas em DMEM e submetidas a ciclos de dissociação na enzima colagenase 1A (Sigma; _) (300 U/mg; em 1% DMEM). A dissociação ocorrerá em 6-8 ciclos (leve agitação; 37 ° C, 10 min cada). A suspensão celular assim obtida será centrifugada (1000 rpm; 4 °C; 10 min) e o pellet será colocado/suspenso em DMEM com soro fetal bovino (FCS; 10%; Sigma; _; 4 °C) para /inativar/ inibem a enzima colagenase/ação/atividade?. O material dissociado será [então] filtrado /em /através de? membrana ([diâmetro do poro:] 70 mm). Em seguida, as células serão contadas em câmara de Neubauer para utilização nos procedimentos a seguir. O sangue materno e do cordão umbilical serão coletados em /um sangue/tubo apropriado contendo EDTA como anticoagulante. O soro será utilizado para detecção viral, e as células leucocitárias serão marcadas após a lise das hemácias.\

Necropsia de Fetos e Natimortos Exames histopatológicos e imuno-histoquímicos e estudo de morfogênese por imagem serão realizados no cérebro e outros órgãos de fetos e natimortos/em consequência da infecção pelo ZIKAV. Além do habitual processamento histológico em parafina, os demais órgãos serão congelados e submetidos à extração de material genético e investigação de RNA viral. O globo ocular também será analisado para avaliar possíveis alterações oculares.

Acompanhamento de recém-nascidos:

Os recém-nascidos serão acompanhados até os 3 anos de idade no ambulatório do IFF, cuja rotina inclui pelo menos 6 consultas no primeiro ano, 4 consultas/ano no segundo e terceiro anos. Um ambulatório multidisciplinar será estabelecido tanto na Unidade de Doenças Infecciosas em Pediatria quanto no Ambulatório Pediátrico para acompanhar a coorte de crianças com chance de exposição vertical ao vírus ZIKA. O ambulatório contará com equipe médica e profissionais das áreas de fisioterapia, fonoaudiologia, psicologia e serviço social. A equipe médica será responsável pelo acompanhamento dos pacientes, em colaboração com especialidades como neurologia, cardiologia e oftalmologia pediátrica, e serviço de genética médica. Sempre que necessário, a admissão desses pacientes para estabelecer [seja] o diagnóstico ou abordagem inicial -{do caso} ocorrerá na enfermaria do DIPe.

A avaliação inicial preconizada para pacientes sabidamente expostos ao vírus ou com microcefalia consistirá nos seguintes exames e/ou avaliações: neurológica, ocular, auditiva, EEG se necessário, ECG, sangue de cordão para RT-PCR e IgM. Dados antropométricos e exame físico do recém-nascido, com ênfase na medida precisa do perímetro cefálico, utilizando como referência a Curva de Intercrescimento (2014), de acordo com a idade gestacional e sexo do paciente. Avaliação pela Genética para detectar características dismórficas ou anomalias congênitas que possam comprometer/afetar outros órgãos.

Exames de imagem:

1. ultrassonografia transfontanela (USTF), como primeira escolha
2. tomografia craniana (TC) sem contraste, se TF não for tecnicamente possível
3. ultrassom abdominal
4. ecocardiograma
5. Ressonância magnética cerebral, quando indicada. g) Triagem Auditiva Neonatal (TAN):

1. Emissões optoacústicas evocadas (EOAE); 24-48 h de vida 2. Potencial Evocado Auditivo de Tronco Encefálico (PEATE/ABR): até 1 mês de vida em crianças com microcefalia. Em caso de reprovação, o reteste deve ser feito em até 30 dias. Em caso de falha no reteste, encaminhar [o RN] imediatamente [para _].

h) Triagem Ocular Neonatal (TON):

1. Inspeção e teste do reflexo vermelho da retina.
2. Exame do fundo ocular (fundoscopia)
3. Documentação com RetCam

Nas consultas subseqüentes, será mantido o acompanhamento clínico, mensuração do CP, avaliação do desenvolvimento (incluindo estimulação precoce) pela fisioterapia e avaliação da morbimortalidade. No primeiro ano de vida, o PEATE será realizado a cada três meses. As consultas subsequentes ocorrerão mensalmente até os 6 meses de idade, a cada dois meses no período de 6 a 12 meses e a cada três meses até os três anos [de vida]. A avaliação oftalmológica (exame de fundo de olho) será realizada a cada retorno.

O acompanhamento neurológico dependerá do estado inicial do paciente. Os pacientes sem microcefalia serão avaliados ao nascimento, 30 dias e 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 e 36 meses. Os pacientes com microcefalia serão avaliados ao nascimento, 30 dias e a cada 2 ou 3 meses, ou mais frequentemente se necessário.

A avaliação do desenvolvimento motor será feita pelo exame de Dubowitz (nas primeiras 72 h), Alberta Infant Motor Scale (AIMS; a cada três meses até a criança andar ou completar 18 meses de vida) e Bayley Test-3ª edição aos 12, 18 e entre 12-36 meses de idade.

A avaliação do desenvolvimento da linguagem será realizada aos 12, 24 e 36 meses, quanto aos possíveis efeitos no neurodesenvolvimento, no desenvolvimento cognitivo e nas habilidades de linguagem.