Vertikaalinen altistuminen Zika-virukselle ja sen seuraukset lasten neurokehitykseen (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

Tutkimuksen päätavoitteena on arvioida vertikaalisen ZIKV-tartunnan luonnollista historiaa raskaudesta kolmannen elinvuoden loppuun ja kliinisten ja neurologisten häiriöiden, erityisesti mikrokefalian, esiintymiseen liittyvien riskitekijöiden olemassaoloa.

Pitkittäistutkimus tehdään raskaudesta kolmannen elinvuoden loppuun, jolloin ZIKV-infektio on pääaltistus.

Näytteen koko on 500 zikavirukselle altistunutta lasta. Otoskoko laskettiin harvinaisille tapahtumille Brasilian tavanomaisen mikrokefalian esiintyvyyden perusteella (2:10 000) ja ZIKAVille altistuneiden raskaana olevien naisten tapausten määrän odotettu lisääntyminen.

Tutkimus tehdään Fernandes Figueiran kansallisessa naisten ja lasten terveysinstituutissa (IFF). Raskaana olevat naiset valitaan IFF:n synnytyshoidon klinikalla ja perheterveysstrategian yksiköissä Centro de Saúde Escola Germano Sinval Fariassa (CDEGSF), jotka molemmat ovat FioCruz/RJ:ltä. Rekrytoimme myös raskaana olevan naisen SMS Rio de Janeiron kliinisestä perheestä.

Osallistumiskriteerit Tutkimuspopulaatio koostuu raskaana olevista naisista, joilla on ZIKAV-infektion kanssa yhteensopivia oireita, joilla on ihottumaa, nivelkipuihin liittyvää kuumetta, lihaskipua, märkimätöntä sidekalvotulehdusta tai päänsärkyä, ja oireettomista raskaana olevista naisista, joilla on samaan aikaan todettu altistumismahdollisuus . Otamme mukaan potilaita, joilla on RT-PCR-positiivinen.

Kaikki raskaana olevat naiset, jotka ovat synnytystä edeltävässä seurannassa IFF:ssä ja CSGSF:ssä, ovat raskausiästä riippumatta kelvollisia alkuvaiheessa altistumattomiksi.

Poissulkemiskriteerit Raskaana olevat naiset, joilla on havaittu kromosomipoikkeavuuksia sikiön aikana tai syntymässä, suljetaan pois.

Altistumisen määritelmä Koska tiedetään, että noin 80 % ZIKAV-infektioista on oireettomia, altistuminen vahvistetaan diagnostisten testien (PCR tai serologiset testit) positiivisuudella. Kun otetaan huomioon serologisten testien saatavuus tulevaisuudessa, altistumisryhmien määrittämisessä käytetään joitain strategioita, koska tähän mennessä on saatavilla vain PCR-testi, joka pysyy positiivisena vain taudin akuutissa vaiheessa.

Kuten yllä on kuvattu, oireelliset naiset lähetetään infektiodiagnostiseen varmistukseen RT-PCR:llä ja serologisiin testeihin denguekuumeen, chikcungunhan, CMV:n, toksoplasmoosin ja vihurirokon varalta.

Naisilla, joilla on oireita ja joilla ei ole oireita, otetaan verinäyte serologisia testejä varten raskauden kolmen kolmanneksen aikana ja syntymän yhteydessä. Verinäytteet säilytetään biovarastoon ZIKA-serologista testausta varten, kun erityisiä serologisia testejä on saatavilla. Näitä peräkkäisiä näytteitä käytetään myös kehitysvaiheessa olevien serologisten testien validointiin.

Vertailtavat altistusryhmät kootaan serologisten testien tulosten perusteella. Oireettomat yksilöt, joiden verinäytteet osoittavat tulevaisuudessa Zika-tartunnan olemassaolon, siirtyvät altistuneiden ryhmään.

Kohortin raskaana olevat naiset, jotka esittävät positiivisia tuloksia tietyissä testeissä (PCR akuutissa vaiheessa ja serologiset testit myöhemmin), katsotaan altistuneiksi infektiolle, kun taas raskaana olevat naiset, joiden tulos on negatiivinen, katsotaan altistumattomiksi.

Tämä toinen ryhmä voidaan luokitella oireettomaan ja oireelliseen. Kolmas ryhmä ovat normaalit lapset, jotka ovat syntyneet äideiltä, ​​joilla ei ole zika-positiivista IgG:tä ja IgM:ää. Jokaista lasta seurataan kolmen vuoden ajan syntymästä eteenpäin.

Analysoitavat tulokset Päätulos on mikrokefalia ja/tai kehityksen viivästyminen käyttäen Bayley Score 3. painosta 12, 18 ja 24-36 kuukauden iässä.

Toissijaiset tutkimustulokset ovat seuraavat: raskauden ultraäänitutkimus, istukan vauriot, silmä-, kuulo-, sydän-, lasten ravitsemustila ja hermoston kehityksen muutokset syntymästä kolmeen ikävuoteen, raskaana olevien naisten kuolema, abortti, sikiökuolema ja kuolema kolme ensimmäistä elinvuotta.

Tiedonkeruu:

Raskaana olevat naiset otetaan mukaan tutkimuksen ensimmäisten 24 kuukauden aikana. Tulosten tunnistamiseksi jokaista lasta seurataan syntymästä kolmen vuoden kronologisen iän loppuun. Tiedonkeruun kokonaistutkimusjakso on 5 vuotta. Selvitys tehdään ajanjaksolla tammi 2016 - maaliskuu 2022.

Tietoja keräävät terveydenhuoltoalan ammattilaiset, jotka ovat yhteydessä terveyspalveluihin ja tarjoavat apua tutkimusväestölle.

Tiedot raskaudesta, syntymästä ja kolmesta ensimmäisestä elinvuodesta saadaan jokaisen naisen haastattelusta tapaamisen jälkeen kyselylomakkeella. Lisäksi kerätään tietoja arkistoihin tätä tarkoitusta varten laadituilla lomakkeilla.

Tiedonkeruulomake (CRF/DCF) rakennetaan ja validoidaan kaikissa ulottuvuuksissaan palveluiden kesken. POP:t laaditaan tutkimuksen vuokaaviota ja jokaista toimenpidettä ja hoitotasoa varten.

• Sosioekonomiset ominaisuudet (koulutus, perheen tulot asukasta kohden, asumisolosuhteet, sanitaatio ja jätehuolto); terveydentila (sananaikainen sairaus).
• ZIKAV-altistumisen historia: sukulaisten, naapureiden ja työtovereiden tunnistaminen Zika-tartunnalla

Tutkimusjoukon seuranta

Raskaana olevien naisten seuranta:

Tutkimukseen osallistuneita raskaana olevia naisia ​​seurataan synnytysklinikalla Fernandes Figueiran kansallisessa naisten ja lasten terveysinstituutissa.

Kun raskaana olevat naiset on otettu mukaan tutkimukseen, konsultaatioita järjestetään kuukausittain ja tutkimukset suoritetaan seuraavan protokollan mukaisesti:

• Sikiön ultraääni jokaisen kolmanneksen aikana
• Serologiset tutkimukset zika-, dengue-, chikungunya-, CMV-, toksoplasmoosi- ja vihurirokkoa varten jokaisen kolmanneksen aikana
• Zika-viruksen PCR, jos oireinen raskaana oleva nainen
• Brasilian terveysministerin Stork Networkin suosittelemat synnytystä edeltävät tutkimukset
• Prenataaliset tutkimukset Brazilian Stork Networkin suosittelemana Lapsivesi voidaan kerätä, jos siihen liittyy synnynnäisiä epämuodostumia.

Doppler:

Napanuora insonoidaan napavaltimon sonogrammin saamiseksi ja siten pulsaatioindeksin (PI), vastusindeksin (RI) ja systolisen huippunopeuden (PSV) arvioimiseksi.

Viruksen havaitseminen seerumissa ja muissa ihmisen eritteissä Potilaiden viruksen havaitsemiseksi RNA uutetaan seerumista ja/tai virtsasta (200 ml) käyttämällä RTP Pathogen -sarjaa (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetty RNA toimii templaattina reaaliaikaisissa /RT-PCR-reaktioissa, kuten ovat kuvanneet: Lanciotti et ai., 2008 ja Faye et ai., 2013.

Viruksen havaitseminen seerumissa ja muissa ihmisen eritteissä Genomisekvensointia varten virusgenomin tietyt alueet monistetaan RT-PCR-menetelmällä. Näin saadut tuotteet puhdistetaan agaroosigeelielektroforeesilla ja uutetaan sitten geelistä käyttämällä QIAquick Gel Extraction (Qiagen) -pakkausta. Uuton jälkeen materiaali kvantifioidaan agaroosigeelissä vertaamalla vyöhykkeiden intensiteettiä käyttäen Low DNA Mass Ladder (Life Technologies) -standardia. Sekvensointiin tarvittava summa välitetään Fiocruzin sekvensointialustalle. Sekvenssejä muokataan manuaalisesti Bioeditillä (v. 7.0.5.3) -ohjelmaa, ja fylogeneettiset analyysit suoritetaan MEGA:lla (v. 5:05) ohjelma.

Istukan ja immunohistokemian analyysi Tuoreet istukat toimitetaan patologisen anatomian ja sytopatologian osastolle (DAPC/DPAC), jossa niitä säilytetään jääkaapissa enintään 48 tuntia. Ne kuvataan, punnitaan ja valokuvataan istukan analyysirutiinin mukaisesti. Sirpaleet korionilevystä, johdosta ja kalvoista poistetaan ja jäädytetään nestetypessä. Istukkalevy (viisi aluetta), naru (vähintään kaksi aluetta) ja korioni (yksi fragmentti) kiinnitetään puskuroituun formaliiniin maksimiaika: 30 h. Sitten ne pilkotaan histologista käsittelyä varten ja upotetaan parafiiniin.

Istukan solujen sekä äidin ja napanuoraveren ja lapsen vanupuikkojen fenotyyppinen karakterisointi virtaussytometrialla Istukan fragmentit kerätään ja säilytetään steriilissä DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [USA]) viljelyalustassa (4 °C) ja pilkotaan useiksi paloiksi (paksuus: 1-2 mm). Katkaisun jälkeen ne pestään DMEM:ssä ja alistetaan dissosiaatiosykleille kollagenaasi 1A (Sigma; _) (300 U/mg; 1 % DMEM) -entsyymissä. Dissosiaatio tapahtuu 6-8 syklissä (lievä sekoitus; 37 °C, kukin 10 min). Näin saatu solususpensio sentrifugoidaan (1000 rpm; 4 °C; 10 min) ja pelletti asetetaan /suspendoidaan DMEM:ään, jossa on vasikan sikiön seerumia (FCS; 10 %; Sigma; _; 4 °C) /inaktivoimiseksi / estävät kollagenaasientsyymiä /toimintaa / aktiivisuutta?. Dissosioitunut materiaali [sitten] suodatetaan /sisään /läpi?a kalvo ([huokosten halkaisija:] 70 mm). Sitten solut lasketaan Neubauer-kammiossa käytettäväksi seuraavissa toimenpiteissä. Äidin ja napanuoran veri kerätään /vereen /sopivaan putkeen, joka sisältää EDTA:ta antikoagulanttina. Seerumia käytetään viruksen havaitsemiseen, ja leukosyyttisolut merkitään punasolujen hajoamisen jälkeen.\

Sikiöiden ja kuolleena syntyneiden ruumiinavaus Histopatologiset ja immunohistokemialliset tutkimukset ja kuvantamismorfogeneesitutkimus tehdään sikiöistä ja kuolleena syntyneistä /ZIKAV-infektion seurauksena aivoista ja muista elimistä. Tavanomaisen histologisen prosessoinnin lisäksi parafiinissa muut elimet jäädytetään ja alistetaan geneettisen materiaalin uuttamiseen ja viruksen RNA:n tutkimiseen. Myös silmämuna analysoidaan mahdollisten silmämuutosten arvioimiseksi.

Vastasyntyneiden seuranta:

Vastasyntyneitä seurataan 3-vuotiaaksi asti IFF:n poliklinikalla, jonka rutiiniin kuuluu ensimmäisenä vuonna vähintään 6 käyntiä, toisena ja kolmantena vuonna 4 käyntiä vuodessa. Sekä lasten infektiotautien yksikköön että lastenpoliklinikalle perustetaan monialainen poliklinikka seuraamaan ZIKA-virukselle vertikaalisesti altistuvien lasten kohorttia. Poliklinikalla on lääkintähenkilöstöä sekä fysioterapian, fonoaudiologian, psykologian ja sosiaalialan ammattilaisia. Lääkäriryhmä vastaa potilaiden seurannasta yhteistyössä neurologian, lasten kardiologian ja oftalmologian sekä lääketieteellisen genetiikan palvelun kanssa. Tarvittaessa nämä potilaat otetaan DIPe-osastolle [joko] diagnoosin tai alustavan lähestymistavan määrittämiseksi.

Alkuarviointi, jota suositellaan potilaille, joiden tiedetään altistuneen virukselle tai joilla on mikrokefalia, koostuu seuraavista tutkimuksista ja/tai arvioinneista: neurologiset, silmät, kuulo, tarvittaessa EEG, EKG, napanuoraveri RT-PCR:lle ja IgM:lle. Antropometriset tiedot ja vastasyntyneen lapsen fyysinen tutkimus painottaen pään ympärysmitan tarkkaa mittaamista Intergrowth Curve (2014) -viittauksella, gestaatioiän ja potilaan sukupuolen mukaan. Geneticsin tekemä arviointi dysmorfisten ominaisuuksien tai synnynnäisten poikkeavuuksien havaitsemiseksi, jotka voivat vaarantaa / vaikuttaa muihin elimiin.

Kuvantamistutkimukset:

1. transfontanelle sonography (USTF), ensimmäisenä valintana
2. kallon tomografia (CT) ilman kontrastia, jos TF ei ole teknisesti mahdollista
3. Vatsan ultraääni
4. Ekokardiogrammi
5. Aivojen magneettikuvaus tarvittaessa. g) Vastasyntyneen kuuloseulonta (TAN):

1. Aiheutetut optoakustiset päästöt (EOAE); 24-48 tuntia elinaikaa 2. Aivorungon kuuloherätyspotentiaali (PEATE/ABR): enintään 1 kuukauden elinikä lapsilla, joilla on mikrokefalia. Epäonnistumisen sattuessa uusintatestaus on tehtävä 30 päivän kuluessa. Jos uusintatesti epäonnistuu, lähetä [huomautus] välittömästi [osoitteeseen _].

h) Vastasyntyneiden silmäseulonta (TON):

1. Verkkokalvon punaisen heijastuksen tarkastus ja testaus.
2. Silmärahaston tutkimus (fundoskopia)
3. Dokumentaatio RetCamilla

Seuraavissa konsultaatioissa ylläpidetään kliinistä seurantaa, PC-mittausta, kehityksen arviointia (mukaan lukien varhainen stimulaatio) fysioterapialla sekä sairastuvuuden ja kuolleisuuden arviointi. Ensimmäisenä elinvuonna PEATE suoritetaan kolmen kuukauden välein. Seuraavat klinikkakäynnit ovat kuukausittain 6 kuukauden ikään asti, kahden kuukauden välein 6-12 kuukauden iässä ja kolmen kuukauden välein kolmeen [elämään] asti. Oftalmologinen arviointi (funduskooppinen tutkimus) suoritetaan joka kerta.

Neurologinen seuranta riippuu potilaan alkuperäisestä tilasta. Potilaat, joilla ei ole mikrokefaliaa, arvioidaan syntyessään, 30 päivän ja 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 ja 36 kuukauden kuluttua. Potilaat, joilla on mikrokefalia, arvioidaan syntymän yhteydessä, 30 päivän kuluttua ja 2 tai 3 kuukauden välein tai tarvittaessa useammin.

Motorisen kehityksen arviointi tehdään Dubowitzin tutkimuksella (ensimmäisten 72 tunnin aikana), Alberta Infant Motor Scale -asteikolla (AIMS; joka kolmas kuukausi, kunnes lapsi kävelee tai täyttää 18 kuukautta) ja Bayley Test-3. painos klo 12, 18 ja 12-36 kuukauden iässä.

Kielellisen kehityksen arviointi suoritetaan 12, 24 ja 36 kuukauden iässä mahdollisten vaikutusten osalta hermoston kehitykseen, kognitiiviseen kehitykseen ja kielitaitoon.