Вертикальное воздействие вируса Зика и его последствия для развития нервной системы ребенка (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

Основная цель исследования — оценить естественное течение вертикальной передачи ЗИКВ от беременности до конца третьего года жизни и наличие факторов риска, связанных с возникновением клинических и неврологических нарушений, особенно микроцефалии.

Будет проведено лонгитюдное исследование с момента беременности до конца третьего года жизни, в течение которого ZIKV-инфекция будет основным воздействием.

Объем выборки составит 500 детей, подвергшихся воздействию вируса Зика. Размер выборки был рассчитан для редких случаев на основе обычной распространенности микроцефалии в Бразилии (2:10 000). и ожидаемое увеличение числа случаев среди беременных женщин, подвергшихся воздействию Зикава.

Исследование будет проводиться в Национальном институте здоровья женщин и детей имени Фернандеса Фигейры (IFF). Беременные женщины будут отобраны в клинику дородового ухода в IFF и в подразделения Стратегии здоровья семьи в Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF), оба из FioCruz/RJ. Мы также наберем беременную женщину из клинической семьи СМС Рио-де-Жанейро.

Критерии включения Исследуемая популяция будет состоять из беременных женщин с симптомами, совместимыми с инфекцией ZIKAV, с кожной сыпью, лихорадкой, связанной с артралгией, миалгией, негнойным конъюнктивитом или головной болью, и бессимптомных беременных женщин, выявленных одновременно с возможностью заражения. . Мы будем включать пациентов с положительной ОТ-ПЦР.

Все беременные женщины, находящиеся под пренатальным наблюдением в IFF и CSGSF, независимо от гестационного возраста, могут быть признаны не подвергавшимися воздействию в начале.

Критерии исключения Беременные женщины с хромосомными аномалиями, обнаруженными во время внутриутробного развития или при рождении, будут исключены.

Определение контакта Учитывая, что около 80% инфекций, вызванных вирусом Зикав, протекают бессимптомно, контакт будет подтвержден положительным результатом диагностических тестов (ПЦР или серологических тестов). Учитывая будущую доступность серологических тестов, некоторые стратегии будут использоваться для определения групп воздействия, поскольку до сих пор доступен только тест ПЦР, который остается положительным только в острой фазе заболевания.

Как описано выше, женщин с симптомами заболевания направляют для подтверждения диагноза инфекции с помощью ОТ-ПЦР и серологических тестов на лихорадку денге, чиккунгунью, ЦМВ, токсоплазмоз и краснуху.

У женщин с симптомами и без них берут кровь на серологические тесты в три триместра беременности и при рождении. Образцы крови будут храниться в биорепозитории для серологического тестирования вируса ZIKA, когда будут доступны специальные серологические тесты. Эти последовательные образцы также будут использоваться для проверки серологических тестов, которые находятся на стадии разработки.

Группы воздействия, подлежащие сравнению, будут составлены на основе результатов серологических тестов. Бессимптомные лица, образцы крови которых указывают на наличие инфекции Зика в будущем, перейдут в группу контактировавших.

Беременные женщины в когорте с положительными результатами определенных тестов (ПЦР в острой фазе и серологические тесты позже) будут считаться подверженными инфекции, тогда как беременные женщины с отрицательными результатами будут считаться не подвергшимися воздействию.

Эту вторую группу можно разделить на бессимптомные и симптоматические. Третья группа будет состоять из нормальных детей, рожденных от матерей без вируса Зика, подтвержденных отрицательными IgG и IgM. Каждый ребенок будет находиться под наблюдением в течение трех лет с момента рождения.

Исходы, подлежащие анализу Основным исходом будет микроцефалия и/или задержка развития по шкале Бейли 3-го издания в возрасте 12, 18 и 24-36 месяцев.

Вторичные результаты исследования будут следующими: состояние УЗИ беременных, травмы плаценты, состояние глаз, слуха, сердца, состояние питания детей и изменения в развитии нервной системы от рождения до трех лет, смерть беременных женщин, аборт, внутриутробная смерть и смерть во время родов. первые три года жизни.

Сбор данных:

Включение беременных женщин произойдет в первые 24 месяца исследования. Чтобы определить результаты, каждый ребенок будет наблюдаться с момента рождения до достижения трех лет в хронологическом порядке. Общий период исследования для сбора данных составит 5 лет. Исследование будет проводиться в период с января 2016 года по март 2022 года.

Данные будут собирать медицинские работники, связанные со службами здравоохранения и оказывающие помощь исследуемой популяции.

Данные о беременности, родах и первых трех годах жизни будут получены из интервью с каждой женщиной с использованием анкеты после приема. Кроме того, данные для записей будут собираться в формах, подготовленных для этой цели.

Форма сбора данных (CRF/DCF) будет составлена ​​и проверена по всем параметрам среди служб. Будут подготовлены СОЗ для схемы исследования и для каждой процедуры и уровня ухода.

• Социально-экономические характеристики (образование, среднедушевой доход семьи, жилищные условия, санитария, вывоз мусора); состояния здоровья (сопутствующие заболевания).
• История воздействия Зикава: идентификация родственников, соседей и коллег по работе с вирусом Зика

Последующее наблюдение за исследуемой популяцией

Наблюдение за беременными:

Беременные женщины, включенные в исследование, будут наблюдаться в дородовой клинике при Национальном бразильском институте здоровья женщин и детей им. Фернандеса Фигейры.

После включения беременных женщин в исследование консультации будут проводиться ежемесячно, а обследования будут проводиться по следующему протоколу:

• УЗИ плода в каждом триместре
• Серологические исследования на Зика, лихорадку денге, чикунгунья, ЦМВ, токсоплазмоз и краснуху каждый триместр
• ПЦР на вирус Зика у беременной женщины с симптомами
• Пренатальные осмотры в соответствии с рекомендациями Stork Network от министра здравоохранения Бразилии.
• Пренатальные обследования, рекомендованные Бразильской сетью аистов. Амниотическая жидкость может быть собрана, если на это указывает наличие сопутствующих врожденных аномалий.

Допплер:

Пуповину облучают, чтобы получить сонограмму пупочной артерии и, таким образом, оценить индекс пульсации (PI), индекс сопротивления (RI) и пиковую систолическую скорость (PSV).

Обнаружение вируса в сыворотке и других выделениях человека. Для обнаружения вируса у пациентов из сыворотки и/или мочи (200 мл) выделяют РНК с использованием набора RTP Pathogen (Stratec Biomedical AG, Биркенфельд, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Выделенная РНК служит матрицей в реакциях ПЦР в режиме реального времени, как описано Lanciotti et al., 2008 e Faye et al., 2013.

Обнаружение вируса в сыворотке и других выделениях человека. Для геномного секвенирования определенные области вирусного генома будут амплифицировать методом ОТ-ПЦР. Полученные таким образом продукты очищают электрофорезом в агарозном геле, а затем экстрагируют из геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction (Qiagen). После экстракции материал будет количественно определен в агарозном геле путем сравнения интенсивностей полос с использованием стандарта Low DNA Mass Ladder (Life Technologies). Сумма, необходимая для секвенирования, будет направлена ​​на платформу секвенирования Fiocruz. Последовательности будут редактироваться вручную с помощью Bioedit (v. 7.0.5.3), а филогенетический анализ будет выполняться с помощью программы MEGA (v. 5:05) программа.

Анализ плаценты и иммуногистохимия Свежие плаценты будут отправлены в отделение патологической анатомии и цитопатологии (DAPC/DPAC), где они будут храниться в холодильнике до 48 часов. Их описывают, взвешивают и фотографируют в соответствии с процедурой анализа плаценты. Фрагменты хорионической пластинки, пуповины и оболочек будут удалены и заморожены в жидком азоте. Плацентарная пластинка (пять участков), пуповина (не менее двух участков) и хорион (один фрагмент) будут фиксироваться в забуференном формалине максимальное время: 30 ч). Затем их раскалывают для гистологической обработки и заливают в парафин.

Фенотипическая характеристика плацентарных клеток, материнской и пуповинной крови и орального мазка ребенка с помощью проточной цитометрии Фрагменты плаценты будут собираться и храниться в стерильной культуральной среде DMEM (Sigma; Сент-Луис, Миссури, [США]) (4 °C) и расщеплены на несколько фрагментов (толщина: 1-2 мм). После расщепления их промывают в DMEM и подвергают циклам диссоциации в ферменте коллагеназе 1А (Sigma; _) (300 ЕД/мг; в 1% DMEM). Диссоциация будет происходить за 6-8 циклов (мягкое перемешивание; 37°С, по 10 мин каждый). Полученную таким образом клеточную суспензию центрифугируют (1000 об/мин; 4 °C; 10 мин) и осадок помещают /суспендируют в DMEM с фетальной телячьей сывороткой (FCS; 10%; Sigma; _; 4 °C) для /инактивации/. ингибировать фермент коллагеназу / действие / активность?. Диссоциированный материал будет [затем] фильтроваться /в/через? мембрана ([диаметр пор:] 70 мм). Затем клетки будут подсчитаны в камере Нейбауэра для использования в следующих процедурах. Материнскую и пуповинную кровь собирают в/кровь/подходящую пробирку, содержащую ЭДТА в качестве антикоагулянта. Сыворотка будет использоваться для обнаружения вируса, а лейкоциты будут отмечены после лизиса эритроцитов.\

Вскрытие плодов и мертворождений Гистопатологические и иммуногистохимические исследования и визуализирующие исследования морфогенеза будут проводиться в головном мозге и других органах плодов и мертворожденных /вследствие инфекции ZIKAV. Помимо обычной гистологической обработки в парафине, другие органы будут заморожены и подвергнуты извлечению генетического материала и исследованию вирусной РНК. Глазное яблоко также будет проанализировано для оценки возможных глазных изменений.

Наблюдение за новорожденными:

Новорожденные будут находиться под наблюдением до 3-летнего возраста в амбулаторной клинике IFF, план которой включает не менее 6 посещений в первый год, 4 посещения в год на втором и третьем годах. Многопрофильная амбулаторная клиника будет создана как в отделении инфекционных болезней в педиатрии, так и в детской поликлинике для наблюдения за группой детей с вероятностью вертикального контакта с вирусом ЗИКА. В поликлинике будет медицинский персонал, а также специалисты в области физиотерапии, фоноаудиологии, психологии и социального обслуживания. Медицинская бригада будет нести ответственность за наблюдение за пациентами в сотрудничестве с такими специальностями, как неврология, детская кардиология и офтальмология, а также со службой медицинской генетики. Всякий раз, когда это необходимо, госпитализация этих пациентов для установления [либо] диагноза, либо для первоначального подхода - {случай} будет происходить в отделении DIPe.

Первоначальная оценка, рекомендованная для пациентов, о которых известно, что они подвергались воздействию вируса, или пациентов с микроцефалией, будет состоять из следующих обследований и/или оценок: неврологическое, глазное, слуховое, ЭЭГ, если необходимо, ЭКГ, пуповинная кровь для ОТ-ПЦР и IgM. Антропометрические данные и физическое обследование новорожденного с акцентом на точное измерение окружности головы с использованием кривой срастания (2014 г.) в качестве эталона в зависимости от гестационного возраста и пола пациента. Оценка генетиком для выявления дисморфических характеристик или врожденных аномалий, которые могут поставить под угрозу / повлиять на другие органы.

Визуальные исследования:

1. ультразвуковое исследование через родничок (USTF) в качестве первого выбора
2. томография черепа (КТ) без контраста, если ТФ технически невозможна
3. УЗИ брюшной полости
4. эхокардиограмма
5. Магнитно-резонансная томография головного мозга по показаниям. g) Скрининг слуха новорожденных (TAN):

1. Вызванная оптико-акустическая эмиссия (ЭОАЭ); 24-48 ч жизни 2. Слуховой вызванный потенциал ствола мозга (СВВП): до 1 мес жизни у детей с микроцефалией. В случае неудачи повторная проверка должна быть проведена в течение 30 дней. В случае неудачного повторного тестирования немедленно перешлите [NB] [к _].

h) Окулярный неонатальный скрининг (TON):

1. Осмотр и тестирование красного отражения сетчатки.
2. Осмотр глазного фонда (фундоскопия)
3. Документация с RetCam

В последующих консультациях будет сохранено клиническое наблюдение, измерение ПК, оценка развития (включая раннюю стимуляцию) с помощью физиотерапии, а также оценка заболеваемости и смертности. В первый год жизни PEATE будет выполняться каждые три месяца. Последующие визиты в клинику будут происходить ежемесячно до 6-месячного возраста, каждые два месяца в период 6-12 месяцев и каждые три месяца до трех лет [жизни]. Офтальмологическое обследование (обследование глазного дна) проводится при каждом возвращении.

Неврологическое наблюдение будет зависеть от исходного состояния пациента. Пациенты без микроцефалии будут оцениваться при рождении, через 30 дней и через 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 и 36 месяцев. Пациенты с микроцефалией будут оцениваться при рождении, через 30 дней и каждые 2 или 3 месяца или чаще, если это необходимо.

Оценка моторного развития будет проводиться с помощью теста Дубовица (в первые 72 часа), моторной шкалы Alberta Infant Motor Scale (AIMS; каждые три месяца, пока ребенок не начнет ходить или не достигнет 18-месячного возраста) и теста Бейли-3-го издания в возрасте 12 лет. 18 и в возрасте от 12 до 36 месяцев.

Оценка языкового развития будет проводиться через 12, 24 и 36 месяцев с учетом возможного влияния на развитие нервной системы, когнитивное развитие и языковые навыки.