Exposición Vertical al Virus Zika y sus Consecuencias para el Neurodesarrollo Infantil (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

El principal objetivo del estudio es evaluar la historia natural de la transmisión vertical del ZIKV desde el embarazo hasta el final del tercer año de vida y la existencia de factores de riesgo asociados a la incidencia de trastornos clínicos y neurológicos, especialmente microcefalia.

Se realizará un estudio longitudinal desde la gestación hasta el final del tercer año de vida, durante el cual la infección por ZIKV será la principal exposición.

El tamaño de la muestra será de 500 niños expuestos al virus del zika. El tamaño de la muestra se calculó para eventos raros con base en la prevalencia habitual de microcefalia en Brasil (2:10.000) y aumento esperado en el número de casos entre mujeres embarazadas expuestas a ZIKAV.

El estudio será realizado en el Instituto Nacional de Salud de la Mujer y del Niño Fernandes Figueira (IFF). Las gestantes serán seleccionadas en el consultorio de prenatal del IFF y en las unidades de la Estrategia de Salud de la Familia, en el Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF), ambas de la FioCruz/RJ. También reclutaremos a mujeres embarazadas de la familia clínica de SMS Rio de Janeiro.

Criterios de inclusión La población de estudio estará compuesta por gestantes que presenten síntomas compatibles con infección por ZIKAV, con exantema cutáneo, fiebre asociada a artralgias, mialgias, conjuntivitis no purulenta, o cefalea y gestantes asintomáticas identificadas al mismo tiempo de posibilidad de exposición . Incluiremos pacientes con RT-PCR positivo.

Todas las gestantes que se encuentran en control prenatal en IFF y CSGSF, independientemente de la edad gestacional, son elegibles como no expuestas al inicio.

Criterios de exclusión Serán excluidas las mujeres embarazadas con anomalías cromosómicas detectadas durante la vida fetal o el parto.

Definición de exposición Teniendo en cuenta que alrededor del 80% de las infecciones por ZIKAV son asintomáticas, la exposición se confirmará por la positividad en las pruebas diagnósticas (PCR o pruebas serológicas). Considerando la disponibilidad futura de pruebas serológicas, se utilizarán algunas estrategias para definir grupos de exposición porque hasta el momento solo se dispone de la prueba PCR, que permanece positiva solo en la fase aguda de la enfermedad.

Como se describió anteriormente, las mujeres sintomáticas serán derivadas para la confirmación del diagnóstico de infección por RT-PCR y pruebas serológicas para dengue, chikcungunha, CMV, toxoplasmosis y rubéola.

A las mujeres con y sin síntomas se les tomará una muestra de sangre para pruebas serológicas en los tres trimestres del embarazo y al nacer. Las muestras de sangre se almacenarán en un biodepósito para pruebas serológicas ZIKA cuando las pruebas serológicas específicas estén disponibles. Estas muestras secuenciales también se utilizarán para validar pruebas serológicas que se encuentran en etapa de desarrollo.

Los grupos de exposición a comparar se formarán con base en los resultados de las pruebas serológicas. Los individuos asintomáticos cuyas muestras de sangre indiquen la presencia de infección por Zika en el futuro, migrarán al grupo de expuestos.

Las gestantes de la cohorte que presenten resultados positivos en pruebas específicas (PCR en fase aguda y pruebas serológicas posteriores) se considerarán expuestas a la infección mientras que las gestantes negativas se considerarán no expuestas.

Este segundo grupo se puede clasificar en asintomático y sintomático. El tercer grupo serán los niños normales nacidos de madres sin zika comprobado por IgG e IgM negativa. Cada niño será seguido durante tres años desde el nacimiento en adelante.

Resultados a analizar El resultado principal será la microcefalia y/o el retraso en el desarrollo utilizando la 3.ª edición de Bayley Score a los 12, 18 y 24-36 meses de edad.

Los resultados secundarios del estudio serán los siguientes: estado de las ecografías del embarazo, lesiones de la placenta, estado ocular, auditivo, cardíaco, nutricional de los niños y cambios en el desarrollo neurológico desde el nacimiento hasta los tres años, muerte en mujeres embarazadas, aborto, muerte fetal y muerte durante el primeros tres años de vida.

Recopilación de datos:

La inclusión de gestantes se producirá en los primeros 24 meses del estudio. Para identificar los resultados, se seguirá a cada niño desde su nacimiento hasta que complete los tres años de edad cronológica. El periodo total de estudio para la recogida de datos será de 5 años. El estudio se realizará en el período enero 2016 - marzo 2022.

Los datos serán recolectados por profesionales de la salud que estén vinculados a los servicios de salud y brinden asistencia a la población de estudio.

Los datos sobre la gestación, el nacimiento y los tres primeros años de vida se obtendrán de una entrevista con cada mujer mediante un cuestionario después de la cita. Además, los datos para los registros se recogerán en formularios preparados al efecto.

El formulario de recolección de datos (CRF/DCF) será construido y validado en todas sus dimensiones entre los servicios. Se prepararán los POP para el diagrama de flujo del estudio y para cada procedimiento y nivel de atención.

• Características socioeconómicas (educación, ingreso familiar per cápita, condiciones de vivienda, saneamiento y recolección de basura); condiciones de salud (comorbilidades).
• Historial de exposición a ZIKAV: identificación de familiares, vecinos y compañeros de trabajo con Zika

Seguimiento de la población de estudio

Seguimiento de las gestantes:

Las mujeres embarazadas incluidas en el estudio serán seguidas en la clínica prenatal, en el Instituto Nacional Brasileño de Salud de la Mujer y el Niño Fernandes Figueira.

Después de la inclusión de las mujeres embarazadas en el estudio, las consultas se realizarán mensualmente y los exámenes se realizarán de acuerdo con el siguiente protocolo:

• Ultrasonido fetal en cada trimestre
• Exámenes serológicos para Zika, dengue, chikungunya, CMV, toxoplasmosis y rubeola cada trimestre
• PCR para virus Zika si mujer embarazada sintomática
• Exámenes prenatales recomendados por la Red Cigüeña del Ministerio de Salud de Brasil
• Exámenes prenatales recomendados por la Red Cigüeña Brasileña El líquido amniótico puede ser recolectado si la presencia de anomalías congénitas asociadas lo indica.

Doppler:

Se insonará el cordón umbilical para obtener una ecografía de la arteria umbilical y así evaluar el índice de pulsatilidad (IP), el índice de resistencia (RI) y la velocidad sistólica máxima (PSV).

Detección de virus en suero y otras secreciones humanas Para la detección de virus en pacientes, se extrae el ARN del suero y/u orina (200 ml) utilizando el kit RTP Pathogen (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Alemania) según las instrucciones del fabricante. El ARN aislado sirve como molde en reacciones de RT-PCR en tiempo real, como se describe en: Lanciotti et al., 2008 y Faye et al., 2013.

Detección de virus en suero y otras secreciones humanas Para la secuenciación genómica, se amplificarán regiones específicas del genoma del virus mediante el método RT-PCR. Los productos así obtenidos serán purificados por electroforesis en gel de agarosa y luego extraídos del gel utilizando el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Después de la extracción, el material se cuantificará en gel de agarosa por comparación entre las intensidades de las bandas utilizando el estándar Low DNA Mass Ladder (Life Technologies). La cantidad necesaria para la secuenciación será enviada a la plataforma de secuenciación de Fiocruz. Las secuencias se editarán manualmente usando el Bioedit (v. 7.0.5.3), y los análisis filogenéticos se realizarán utilizando el programa MEGA (v. 5:05) programa.

Análisis de la placenta e inmunohistoquímica Las placentas frescas serán enviadas al Departamento de Anatomía Patológica y Citopatología (DAPC/DPAC) donde se mantendrán en refrigeración hasta por 48 h. Se describen, pesan y fotografían de acuerdo con la rutina para el análisis de placenta. Los fragmentos de la placa coriónica, el cordón y las membranas se extraerán y congelarán en nitrógeno líquido. La placa placentaria (cinco zonas), el cordón (al menos dos zonas) y el corion (un fragmento) se fijarán en formalina tamponada tiempo máximo: 30 h). Luego se escindirán para el procesamiento histológico y se incluirán en parafina.

Caracterización fenotípica de células placentarias y sangre materna y de cordón umbilical e hisopado oral infantil mediante citometría de flujo Los fragmentos de placenta se recolectarán y mantendrán en medio de cultivo DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [EE. UU.]) estéril (4 °C) y se escindirán en varios fragmentos (grosor: 1-2 mm). Después de la escisión, se lavan en DMEM y se someten a ciclos de disociación en enzima colagenasa 1A (Sigma; _) (300 U/mg; en DMEM al 1%). La disociación se producirá en 6-8 ciclos (agitación suave, 37 ° C, 10 min cada uno). La suspensión celular así obtenida se centrifugará (1000 rpm; 4 °C; 10 min) y se colocará/suspenderá el sedimento en DMEM con suero fetal bovino (FCS; 10%; Sigma; _; 4 °C) para /inactivar/ inhibir la enzima colagenasa /acción /actividad?. El material disociado [entonces] se filtrará /en /a través de?a membrana ([diámetro de poro:] 70 mm). Luego, las células se contarán en una cámara de Neubauer para su uso en los siguientes procedimientos. La sangre materna y del cordón umbilical se recogerá en /a sangre /un tubo apropiado que contenga EDTA como anticoagulante. El suero se utilizará para la detección viral y las células leucocitarias se marcarán después de la lisis de los glóbulos rojos.\

Necropsia de fetos y mortinatos Se realizarán exámenes histopatológicos e inmunohistoquímicos y estudios de morfogénesis por imágenes en el cerebro y otros órganos de fetos y mortinatos / como consecuencia de la infección por ZIKAV. Además del habitual procesamiento histológico en parafina, los demás órganos serán congelados y sometidos a extracción de material genético e investigación de ARN viral. También se analizará el globo ocular para evaluar posibles cambios oculares.

Seguimiento de recién nacidos:

Los recién nacidos serán seguidos hasta los 3 años de edad en la consulta externa del IFF, cuya rutina incluye al menos 6 visitas en el primer año, 4 visitas/año en el segundo y tercer año. Se establecerá una clínica ambulatoria multidisciplinaria tanto en la Unidad de Enfermedades Infecciosas en Pediatría como en la Clínica ambulatoria pediátrica para dar seguimiento a la cohorte de niños con posibilidad de exposición vertical al virus ZIKA. El ambulatorio contará con personal médico, y profesionales en las áreas de fisioterapia, fonoaudiología, psicología y servicio social. El equipo médico será el encargado de realizar el seguimiento de los pacientes, en colaboración con especialidades como neurología, cardiología y oftalmología pediátricas y el servicio de genética médica. Siempre que sea necesario, el ingreso de estos pacientes para establecer [ya sea] el diagnóstico o el abordaje inicial -{del caso}- se realizará en la sala de DIPe.

La evaluación inicial recomendada para pacientes con exposición conocida al virus o con microcefalia consistirá en los siguientes exámenes y/o evaluaciones: neurológico, ocular, auditivo, EEG si es necesario, ECG, sangre de cordón para RT-PCR e IgM. Datos antropométricos y exploración física del recién nacido, con énfasis en la medición precisa del perímetro cefálico utilizando como referencia la Curva de Intercrecimiento (2014), según edad gestacional y sexo del paciente. Evaluación por parte de la Genética para detectar características dismórficas o anomalías congénitas que puedan comprometer/afectar otros órganos.

Exámenes de imagen:

1. ecografía transfontanelar (USTF), como primera opción
2. Tomografía craneal (TC) sin contraste, si la TF no es técnicamente posible
3. Ultrasonido abdominal
4. Ecocardiograma
5. Resonancia magnética cerebral, cuando esté indicada. g) Examen de audición para recién nacidos (TAN):

1. Emisiones optoacústicas evocadas (EOAE); 24-48 h de vida 2. Potenciales Evocados Auditivos de Tronco Cerebral (PEATE/ABR): hasta 1 mes de vida en niños con microcefalia. En caso de falla, se debe volver a realizar la prueba dentro de los 30 días. En caso de que falle la nueva prueba, envíe [el NB] inmediatamente [a _].

h) Tamizaje Neonatal Ocular (TON):

1. Inspección y prueba de reflexión roja retinal.
2. Examen del fondo del ojo (fondoscopia)
3. Documentación con RetCam

En las consultas posteriores se mantendrá el seguimiento clínico, medición de CP, evaluación del desarrollo (incluida la estimulación temprana) por fisioterapia y evaluación de la morbimortalidad. En el primer año de vida se realizará PEATE cada tres meses. Las siguientes visitas a la clínica se realizarán mensualmente hasta los 6 meses de edad, cada dos meses en el período de 6 a 12 meses y cada tres meses hasta los tres años [de vida]. La evaluación oftalmológica (examen de fondo de ojo) se realizará en cada retorno.

El seguimiento neurológico dependerá del estado inicial del paciente. Los pacientes sin microcefalia serán evaluados al nacimiento, a los 30 días ya los 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 y 36 meses. Los pacientes con microcefalia serán evaluados al nacer, a los 30 días y cada 2 o 3 meses, o con mayor frecuencia si es necesario.

La evaluación del desarrollo motor se hará mediante el examen de Dubowitz (en las primeras 72 h), Escala Motora Infantil de Alberta (AIMS; cada tres meses hasta que el niño camine o complete los 18 meses de vida), y Bayley Test-3ª edición a los 12, 18 y entre 12-36 meses de edad.

La evaluación del desarrollo del lenguaje se realizará a los 12, 24 y 36 meses, con respecto a los posibles efectos sobre el neurodesarrollo, el desarrollo cognitivo y las habilidades del lenguaje.