Identificazione dei sottogruppi di cellule B responsabili della risposta antipneumococcica (PNEUMOVACB)

Lo scopo di questo studio è identificare quali specifici sottoinsiemi di cellule B sono/sono responsabili della produzione di polisaccaridi capsulari anti-pneumococco protettivi IgM, IgG2 e IgA (capPS) in risposta all'immunizzazione di individui sani con il Pneumovax, un prototipo di vaccino T-indipendente di tipo 2. In altre parole, da quali cellule B derivano le plasmacellule che secernono IgM, G2 e A? Per rispondere a questa domanda, si sfrutterà l'esclusiva firma VDJ della catena pesante Ig espressa da ciascun clone di cellule B e la strategia si baserà sulla ricerca di filiazioni clonali tra plasmablasti (PB)/plasmacellule (PC) e diverse cellule B sottopopolazioni. Pertanto, gli individui sani saranno vaccinati con Pneumovax e i campioni di sangue saranno raccolti al giorno 0, 7, 14, 28 e 56. Partendo da questi campioni di sangue, diversi sottoinsiemi di cellule B (in particolare IgM+IgD+CD27+ e cellule B a memoria commutata IgM-IgD-CD27+) e il picco PB/PC al giorno 7 dopo la vaccinazione saranno isolati mediante cell sorting. Il PB che secerne CapPS non può essere isolato in modo specifico, ma i ricercatori presumono che rappresenteranno la maggior parte del PB/PC isolato al picco della risposta. Pertanto, il giorno 7-PB/PC sarà selezionato sia in massa che come singole celle in piastre PCR da 96 pozzetti. L'RNA sarà estratto dal bulk sorted PB/PC, e i trascritti VDJ-µ, -alfa e -gamma Ig saranno amplificati mediante RT-PCR e analizzati con il metodo di spettrotipizzazione H-CDR per identificare la sequenza delle firme VDJ dominanti che molto probabilmente corrispondono a cellule che secernono anti-capPS. In parallelo, per ogni singola cellula PB/PC, i trascritti genici della catena leggera Ig pesante e corrispondente saranno amplificati mediante RT-PCR nidificata, sequenziati e, a condizione che la catena pesante contenga una firma VDJ dominante, saranno clonati nell'espressione eucariotica vettori per produrre Abs umani monoclonali. Gli anticorpi ricombinanti saranno quindi testati per la reattività contro capPS dal vaccino mediante ELISA. Quando le firme VDJ di capPS saranno convalidate, con questo potente strumento molecolare, i ricercatori cercheranno la presenza di queste firme attraverso la PCR specifica per VDJ su cDNA preparato dai diversi sottogruppi di cellule B.