Trapianto di cellule staminali allogeniche non mieloablative da donatore non correlato HLA compatibile per il trattamento di disturbi ematologici

Trapianto allogenico ed effetto trapianto contro malattia Negli ultimi tre decenni, il trapianto di innesti di midollo allogenico è emerso come una terapia unica ed efficace per i pazienti con neoplasie ematologiche, sindromi da insufficienza midollare e altre malattie letali genetiche e acquisite dell'emopoiesi.1-9 Il trapianto allogenico si traduce potenzialmente in esiti curativi per i pazienti con leucemia acuta, leucemia mieloide cronica, anemia aplastica e neoplasie linfoidi per i quali le terapie standard potrebbero non essere efficaci. L'effetto antitumorale mediato dai linfociti allogenici è un fattore essenziale per eliminare la malattia residua post-trapianto e prevenire le successive ricadute.10-14 Numerose osservazioni in pazienti sottoposti a trapianto allogenico di midollo osseo per neoplasie ematologiche hanno dimostrato in modo convincente l'evidenza di un effetto graft-versus-disease (GVD) mediato dai linfociti presenti nell'innesto del donatore. Le prove a sostegno dell'importanza di questo fenomeno includono: 1) i tassi di ricaduta dei riceventi di BMT singenico sono maggiori rispetto ai riceventi allogenici; 2) i riceventi di BMT allogenico che non sviluppano la malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD) hanno un tasso di recidiva significativamente maggiore rispetto ai riceventi di BMT allogenico che sviluppano GVHD; 3) sono state osservate remissioni complete in pazienti con malattia recidivante dopo BMT allogenico in associazione con riacutizzazioni di GVHD; 4) i destinatari di BMT impoverito di cellule T, un metodo di profilassi GVHD, ricaduta più frequentemente rispetto ai destinatari di BMT impoverito di cellule non T; e 5) l'uso di un innesto di midollo non correlato in entrambi i BMT allogenici impoveriti di cellule T e non è associato a una ridotta incidenza di recidiva.

La prova più diretta del ruolo dei linfociti allogenici nella mediazione di un effetto antitumorale è stata che i pazienti che manifestano una ricaduta in seguito a trapianto allogenico possono essere trattati con successo mediante l'infusione di leucociti donatori.15-22 Riassumendo l'esperienza europea, Kolb et al. hanno riferito che oltre l'80% dei pazienti con LMC che ricadono nella fase cronica dopo il trapianto possono ottenere una seconda remissione completa dopo l'infusione di leucociti del donatore nel trattamento della LMC recidivante dopo il trapianto. Le remissioni complete con l'uso del DLI per il trattamento delle leucemie acute recidivanti, della leucemia linfatica cronica, delle sindromi mielodisplastiche, del mieloma multiplo e della policitemia vera, sebbene inferiori a quelle osservate nella LMC, sono state ben dimostrate da diversi gruppi. Inoltre, nei pazienti con linfoma non-Hodgkin e mieloma multiplo è stato osservato un potente effetto graft versus disease associato al trapianto allogenico e all'infusione di leucociti da donatore.23-25 Pertanto, il trapianto allogenico offre un approccio unicamente efficace per sradicare la neoplasia ematologica in cui la terapia mieloablativa determina una profonda citoriduzione del tumore e i linfociti del donatore eliminano successivamente la malattia minima residua attraverso meccanismi immunologici.

Limiti nell'applicazione del trapianto allogenico L'uso del trapianto allogenico è stato limitato dalla significativa morbilità e mortalità correlata al trattamento associata a questa procedura. I pazienti spesso manifestano una significativa disfunzione d'organo a causa della tossicità correlata al regime. La malattia del trapianto contro l'ospite da moderata a grave si verifica in circa il 40% dei pazienti sottoposti a trapianti convenzionali di fratelli compatibili e aumenta l'incidenza nei pazienti più anziani e in quelli che ricevono innesti non correlati o non corrispondenti.26-28 Le infezioni opportunistiche dovute a disfunzioni immunitarie rimangono una delle principali fonti di morbilità e mortalità, in particolare nei pazienti più anziani. L'applicazione del trapianto allogenico è quindi limitata ai pazienti più giovani con normale funzione d'organo sottostante. Poiché l'età media di molte neoplasie ematologiche può superare i 60 anni, la maggior parte dei pazienti con queste patologie non è considerata candidata a questa procedura.

La difficoltà nell'applicare il trapianto allogenico nei pazienti con neoplasie ematologiche è particolarmente evidenziata nei pazienti con neoplasie linfoidi come il mieloma multiplo, la leucemia linfatica cronica e il linfoma di basso grado. Questi disturbi sono incurabili con la chemioterapia a dosi standard, ma possono seguire un decorso relativamente indolente per diversi anni prima che i pazienti sviluppino una malattia chemioresistente progressiva. Il trapianto allogenico è stato associato alla sopravvivenza libera da malattia a lungo termine in questi contesti, ma è associato a un'elevata incidenza di mortalità correlata al trapianto iniziale. Le strategie per limitare la tossicità correlata al trapianto sono essenziali per tradurre la ridotta incidenza di recidive in un miglioramento della sopravvivenza globale in questa popolazione di pazienti.

Trapianto allogenico non mieloablativo Un approccio per limitare la tossicità del trapianto allogenico è stato l'uso di regimi non mieloablativi che precedono l'infusione di cellule allogeniche.29-33 Con questa strategia, i pazienti ricevono una terapia immunosoppressiva che consente l'attecchimento delle cellule del donatore senza l'immediata eradicazione dell'emopoiesi del paziente. Il meccanismo principale mediante il quale la malattia di base viene eradicata non è attraverso la citoriduzione mediata dalla chemioterapia, ma piuttosto attraverso l'effetto del trapianto contro il tumore mediato dai linfociti del donatore. Di conseguenza, i pazienti sperimentano una tossicità molto inferiore correlata al regime. Pertanto, l'adozione di questa strategia può consentire l'uso del trapianto allogenico in contesti patologici e popolazioni di pazienti per i quali non era stato facilmente applicabile in passato.

Negli ultimi anni, l'uso del trapianto non mieloablativo si è rapidamente ampliato. Sono stati sviluppati diversi regimi di condizionamento a intensità ridotta, tra cui fludarabina e ciclofosfamide; fludarabina e melfalan; fludarabina, globulina antitimocitica e busulfano a basso dosaggio; e fludarabina e trauma cranico a basso dosaggio. Gli investigatori hanno dimostrato la fattibilità di questo approccio terapeutico con la maggior parte dei pazienti che dimostrano attecchimento da donatore, diminuzione della tossicità correlata al regime e regressione della malattia mediata dal trapianto. In alcuni studi, i pazienti dimostrano un periodo di chimerismo misto donatore/ospite in cui l'infusione di linfociti del donatore è associata al raggiungimento del chimerismo completo del donatore.

Sebbene la tossicità correlata al regime sia diminuita a seguito di regimi di condizionamento intensivi ridotti, la malattia del trapianto contro l'ospite e le infezioni opportunistiche rimangono una fonte significativa di morbilità e mortalità dopo trapianto allogenico non mieloablativo. L'impatto del trapianto non mieloablativo sulla ricostituzione immunologica non è stato completamente definito. La persistenza delle cellule che presentano l'antigene dell'ospite nel periodo post-trapianto può aumentare l'incidenza della GVHD a causa della presentazione di alloantigeni alle cellule T del donatore. Al contrario, l'immunità cellulare residua dell'ospite può fornire una maggiore protezione contro i patogeni infettivi e consentire una formazione più rapida dei linfociti del donatore. Da notare che le infezioni da CMV rimangono comuni in questa popolazione ma sono presenti più tardi nel periodo post-trapianto, tipicamente dopo il raggiungimento del pieno chimerismo del donatore.34

Trapianto allogenico non mieloablativo in combinazione con la terapia CAMPATH Un approccio per ridurre l'incidenza di GVHD in seguito a trapianto non mieloablativo è l'aggiunta di CAMPATH al regime di preparazione per esaurire le cellule T sia del ricevente che dell'innesto in arrivo.35 CAMPATH-1H (Alemtuzumab) è un anticorpo monoclonale umanizzato derivato da DNA ricombinante diretto contro la glicoproteina di superficie cellulare, CD52; prodotto in sospensione di cellule di mammifero (ovaio di criceto cinese).36-39 Campath-1H è indicato per il trattamento della leucemia linfatica cronica a cellule B in pazienti che sono stati trattati con agenti alchilanti e hanno fallito la terapia con fludarabina. Campath-1H è stato utilizzato in pazienti con neutropenia autoimmune, linfoma non Hodgkin, artrite reumatoide e vasculite. È stato anche utilizzato per prevenire la malattia del trapianto contro l'ospite nei pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali. La profilassi della GVHD era con la sola ciclosporina A.

Mackinnon et al. hanno studiato un regime di condizionamento non mieloablativo in 47 pazienti con neoplasie ematologiche che ricevevano cellule staminali allogeniche del midollo osseo da donatori compatibili e non correlati.40 La maggior parte dei pazienti presentava caratteristiche ad alto rischio, incluso il fallimento di un precedente trapianto (29 individui). Venti dei trapianti non erano corrispondenti per gli alleli HLA di classe I e/o di classe II. Hanno aggiunto CAMPATH-1H a un regime preparatorio di fludarabina e melfalan e somministrato o staminali del sangue periferico mobilizzato da GCSF o midollo osseo non manipolato da donatori non imparentati abbinati. Il fallimento primario del trapianto si è verificato solo in 2 dei 44 pazienti valutabili (4,5%). Gli studi sul chimerismo in 34 pazienti hanno indicato che la maggioranza (85,3%) ha raggiunto il chimerismo iniziale del donatore completo. Solo 3 pazienti hanno sviluppato GVHD acuta di grado da III a IV e nessun paziente ha ancora sviluppato GVHD cronica estesa. La probabilità stimata di mortalità senza recidiva al giorno 100 era del 14,9% (intervallo di confidenza al 95% [CI], 4,7%-25,1%). Con un follow-up mediano di 344 giorni (range, 79-830), la sopravvivenza globale e libera da progressione a 1 anno è stata del 75,5% (95% CI, 62,8%-88,2%) e 61,5% (IC 95%, 46,1%-76,8%), rispettivamente. Successivamente è stato riferito che un sottogruppo significativo di pazienti ha dimostrato evidenza di riattivazione del CMV.41 Tuttavia, la presenza di CMV non ha avuto un impatto negativo sulla sopravvivenza. Sebbene i ricercatori abbiano notato la necessità di un follow-up più lungo di questa coorte, hanno ritenuto che questo regime preparatorio che incorpora CAMPATH-1H in vivo fosse associato a un attecchimento duraturo e a una tossicità minima correlata al trattamento.

Ricostituzione immunitaria dopo il trapianto allogenico Il trapianto allogenico è associato a un periodo di disfunzione immunitaria che persiste caratteristicamente per almeno 1 anno dopo il trapianto.42,43 Il recupero immunitario dipende dalla ricostituzione di elementi di immunità umorale e cellulare e dalla loro rieducazione nel ricevente del trapianto. È particolarmente ritardato nei riceventi di un innesto non imparentato o impoverito di cellule T. Il periodo post-trapianto è caratterizzato da livelli ridotti di cellule T helper, un'inversione associata del rapporto C4:CD8 e l'attenuazione delle risposte delle cellule T agli stimoli mitogeni e agli antigeni di richiamo.44-46 La disfunzione immunitaria umorale è associata alla perdita dei livelli di anticorpi protettivi contro i patogeni batterici e virali, alla riduzione dei livelli di immunoglobuline circolanti, in particolare del sottotipo IgG2, e alla ridotta complessità del pattern di riarrangiamento genico delle immunoglobuline.47,48

Cellule dendritiche e ricostituzione immunitaria La natura del recupero delle cellule che presentano l'antigene come le cellule dendritiche gioca probabilmente un ruolo essenziale nella ricostituzione dell'immunità post-trapianto e nella tolleranza dell'ospite/donatore. Le cellule dendritiche (DC) formano una complessa rete di cellule presentanti l'antigene che svolgono un ruolo fondamentale nell'induzione dell'immunità primaria e nella modulazione della tolleranza.49.50 Le DC sono le cellule presentanti l'antigene più potenti e sono in grado di indurre risposte immunitarie primarie contro nuovi antigeni attraverso la ricca espressione di molecole di costimolazione e di adesione. Le DC generate da lignaggi non mieloidi o in uno stato immaturo possono mediare la tolleranza immunitaria e indirizzare le risposte delle cellule T verso un fenotipo TH2. Nel sangue periferico sono state identificate popolazioni DC distinte che si differenziano per la presenza di marcatori mieloidi (CD11c) o plasmacitoidi (CD123).51,52 Le cellule DC2 (plasmocitoidi) sono caratterizzate dall'espressione delle citochine di tipo 2 e quindi avviano una risposta Th2, mentre le cellule DC1 (mieloidi) avviano la risposta delle citochine Th1. Le DC isolate da pazienti con tumore maligno dimostrano carenze funzionali che potenzialmente contribuiscono alla mancanza di riconoscimento del tumore da parte dell'immunità dell'ospite. Poco si sa sull'attecchimento delle DC o sulle caratteristiche fenotipiche e funzionali dopo il trapianto allogenico. È probabile che le interazioni delle DC con le popolazioni effettrici siano uniche dopo il condizionamento non mieloablativo data la presenza di chimerismo misto donatore/ricevente che può caratterizzare il periodo post-trapianto.

In un modello murino, Shlomchik et al. hanno dimostrato che la persistenza delle cellule che presentano l'antigene dell'ospite dopo il trapianto era associata allo sviluppo di GVHD.53 In questo modello, la DC ospite in grado di presentare antigeni di istocompatibilità minori alle cellule T del donatore infuse potenzialmente avvia l'attivazione delle cellule T e una cascata di citochine Th-1 associata implicata nella patogenesi dell'aGVHD. I livelli relativi dei sottoinsiemi DC1/DC2 nel trapianto ematopoietico sono fortemente correlati all'incidenza della malattia del trapianto contro l'ospite e all'incidenza della recidiva. La mobilizzazione dello stelo mediata dal G-CSF è associata a livelli aumentati di popolazioni DC2.54 In un modello animale, l'infusione di splenociti e midollo osseo da donatori trattati con G-CSF è stata associata alla comparsa di un fenotipo DC2 e, quindi, alla tolleranza.55 In uno studio su pazienti sottoposti a trapianto allogenico, la presenza di un aumento del numero di cellule DC2 nel trapianto ematopoietico è stata associata a una diminuzione della GVHD e a un aumento delle ricadute e a esiti peggiori.56 L'impatto del chimerismo DC, i modelli di ricostituzione e la presenza di popolazioni DC1 e DC2 a seguito di trapianto allogenico non mieloablativo non è stato ben studiato. Studi recenti hanno dimostrato che il CD52 è espresso da alcune popolazioni di DC e suggeriscono che la terapia CAMPATH può influire sulla presentazione dell'antigene a causa della deplezione delle popolazioni di DC dall'ospite.57-59 L'esaurimento delle DC derivate dall'ospite può diminuire nell'incidenza di GVHD, mentre la presenza di DC del donatore è probabilmente essenziale per la ricostituzione dell'immunità cellulare.

Nello studio proposto, intendiamo esaminare l'applicazione di un regime preparativo basato su CAMPATH in pazienti con neoplasie ematologiche sottoposti a trapianto di cellule staminali allogeniche non mieloablative da un donatore non correlato. Lo studio coinvolgerà pazienti che altrimenti non sarebbero candidati per un regime di condizionamento mieloablativo convenzionale a causa dell'età o della disfunzione d'organo e che non hanno donatori di pari livello HLA. Includerà anche pazienti affetti da neoplasie linfoidi come linfoma di basso grado, CLL e mieloma multiplo che hanno sperimentato una mortalità correlata al trapianto inaccettabilmente elevata con trapianto allogenico convenzionale. L'inclusione di entrambe le neoplasie ematologiche mieloidi e linfoidi nella coorte dello studio ottimizzerà l'arruolamento e non limiterà la capacità alla capacità di perseguire gli obiettivi dello studio. I modelli di attecchimento, malattia del trapianto contro l'ospite, ricostituzione immunitaria e chimerismo donatore/ospite sono principalmente determinati dal regime di preparazione e dalla strategia del trapianto e non dovrebbero differire considerevolmente all'interno della coorte di pazienti.

Per il regime di condizionamento, abbiamo scelto una dose intermedia di ciclofosfamide e fludarabina nel tentativo di ridurre al minimo l'incidenza del rigetto del trapianto senza aumentare la frequenza di morbilità e mortalità correlata al trattamento. Sulla base del lavoro di MacKinnon et al, aggiungeremo CAMPATH-1H al regime preparatorio per ridurre ulteriormente l'incidenza di GVHD e promuovere l'attecchimento di cellule staminali del donatore. Seguendo questo regime i livelli circolanti di CAMPATH sono presenti per diverse settimane dopo il trapianto e possono esaurire eccessivamente le cellule T del donatore così come eliminare le popolazioni DC dall'innesto del donatore. Nel tentativo di migliorare la ricostituzione immunitaria post-trapianto e limitare i rischi di infezione e ricaduta, abbiamo scelto una dose più bassa di CAMPATH e seguiremo i livelli in momenti seriali post-trapianto.

I principali endpoint della sperimentazione includeranno la definizione: 1) del profilo di tossicità correlato al trattamento e del recupero ematopoietico post-trapianto 2) dell'incidenza e della gravità dell'infezione da CMV e della GVHD acuta e cronica 3) delle caratteristiche fenotipiche e funzionali delle popolazioni di cellule DC e T post-trapianto; e 4) i modelli di chimerismo donatore/ospite nelle popolazioni di cellule DC e T e la sua correlazione con GVHD. Come endpoint secondario, verranno determinati DFS e OS a 1 e 2 anni.