Nemyeloablativní alogenní transplantace kmenových buněk od HLA-shodného nepříbuzného dárce pro léčbu hematologických poruch

Alogenní transplantace a vliv štěpu proti onemocnění Během posledních tří desetiletí se transplantace alogenních dřeňových štěpů objevila jako jedinečně účinná terapie pro pacienty s hematologickými malignitami, syndromy selhání dřeně a dalšími letálními genetickými a získanými onemocněními krvetvorby.1-9 Alogenní transplantace potenciálně vede k léčebným výsledkům u pacientů s akutní leukémií, chronickou myeloidní leukémií, aplastickou anémií a lymfoidními malignitami, u kterých standardní terapie nemusí být účinné. Protinádorový účinek zprostředkovaný alogenními lymfocyty je zásadním faktorem při eliminaci reziduálního onemocnění po transplantaci a prevenci následného relapsu.10-14 Četná pozorování u pacientů podstupujících alogenní transplantaci kostní dřeně kvůli hematologickým malignitám přesvědčivě prokázala účinek graft-versus-disease (GVD) zprostředkovaný lymfocyty přítomnými v dárcovském štěpu. Podpůrné důkazy pro důležitost tohoto fenoménu zahrnují: 1) četnost relapsů u příjemců syngenní BMT je vyšší než u alogenních příjemců; 2) příjemci alogenní BMT, u kterých se nevyvine reakce štěpu proti hostiteli (GVHD), mají významně vyšší míru relapsů než příjemci alogenní BMT, u kterých se GVHD vyvine; 3) úplné remise byly pozorovány u pacientů s relapsem onemocnění po alogenní BMT ve spojení se vzplanutím GVHD; 4) příjemci BMT s deplecí T-buněk, což je metoda profylaxe GVHD, relabují častěji než příjemci BMT bez deplece T-buněk; a 5) použití nepříbuzného štěpu kostní dřeně u alogenní BMT bez deplece T-buněk i bez deplece T-buněk je spojeno se sníženým výskytem relapsu.

Nejpřímějším důkazem o úloze alogenních lymfocytů při zprostředkování protinádorového účinku je, že pacienti, u kterých dojde po alogenní transplantaci k relapsu, mohou být úspěšně léčeni infuzí dárcovských leukocytů.15-22 Shrneme-li evropské zkušenosti, Kolb et al uvedli, že více než 80 % pacientů s CML, kteří se po transplantaci vrátí do chronické fáze, může dosáhnout druhé kompletní remise po infuzi infuze dárcovských leukocytů při léčbě relapsu CML po transplantaci. Kompletní remise při použití DLI k léčbě relabujících akutních leukémií, chronické lymfocytární leukémie, myelodysplastických syndromů, mnohočetného myelomu a polycythemia vera, i když nižší než u CML, byly dobře prokázány několika skupinami. Kromě toho byl u pacientů s nehodgkinským lymfomem a mnohočetným myelomem pozorován silný účinek štěpu proti onemocnění spojený s alogenní transplantací a infuzí dárcovských leukocytů.23-25 Alogenní transplantace tedy nabízí jedinečně účinný přístup k eradikaci hematologické malignity, kdy myeloablativní terapie vede k hluboké cytoredukci nádoru a dárcovské lymfocyty následně eliminují minimální reziduální onemocnění prostřednictvím imunologických mechanismů.

Omezení při aplikaci alogenní transplantace Použití alogenní BMT bylo omezeno významnou morbiditou a mortalitou související s léčbou spojenými s tímto postupem. Pacienti často pociťují významnou orgánovou dysfunkci v důsledku toxicity související s režimem. Středně těžká až závažná reakce štěpu proti hostiteli se vyskytuje přibližně u 40 % pacientů podstupujících konvenční transplantaci shodného sourozence a zvyšuje se výskyt u starších pacientů a těch, kteří dostávají nepříbuzné nebo neshodné štěpy.26-28 Oportunní infekce způsobené imunitní dysfunkcí zůstávají hlavním zdrojem morbidity a mortality zejména u starších pacientů. Aplikace alogenní transplantace je proto omezena na mladší pacienty s normální funkcí základních orgánů. Protože střední věk mnoha hematologických malignit může přesáhnout 60 let, většina pacientů s těmito poruchami není považována za kandidáty pro tento postup.

Obtížnost aplikace alogenní transplantace u pacientů s hematologickými malignitami je zvláště zdůrazněna u pacientů s lymfoidními malignitami, jako je mnohočetný myelom, chronická lymfocytární leukémie a lymfom nízkého stupně. Tyto poruchy jsou neléčitelné standardní dávkovou chemoterapií, ale mohou následovat relativně indolentní průběh po dobu několika let, než se u pacientů rozvine progresivní chemorezistentní onemocnění. Alogenní transplantace byla v těchto podmínkách spojena s dlouhodobým přežitím bez onemocnění, ale je spojena s vysokou incidencí úmrtnosti související s předčasným transplantací. Strategie pro omezení toxicity související s transplantací jsou zásadní pro převedení sníženého výskytu relapsu do zlepšení celkového přežití u této populace pacientů.

Nemyeloablativní alogenní transplantace Jedním z přístupů k omezení toxicity alogenní transplantace bylo použití nemyeloablativních režimů předcházejících infuzi alogenních buněk.29-33 S touto strategií dostávají pacienti imunosupresivní terapii, která umožňuje přihojení dárcovských buněk bez okamžité eradikace pacientovy krvetvorby. Primárním mechanismem, kterým je základní onemocnění eradikováno, není cytoredukce zprostředkovaná chemoterapií, ale spíše účinek štěpu proti nádoru zprostředkovaný dárcovskými lymfocyty. Výsledkem je, že pacienti pociťují mnohem menší toxicitu související s režimem. Přijetí této strategie proto může umožnit použití alogenní transplantace u nemocí a populací pacientů, pro které nebyla v minulosti snadno použitelná.

Za posledních několik let se použití nemyeloablativních transplantací rychle rozšířilo. Bylo vyvinuto několik režimů kondicionování se sníženou intenzitou, včetně fludarabinu a cyklofosfamidu; fludarabin a melfalan; fludarabin, anti-thymocytární globulin a busulfan v nízké dávce; a fludarabin a nízké dávky TBI. Vyšetřovatelé prokázali proveditelnost tohoto léčebného přístupu, přičemž většina pacientů prokázala přihojení dárce, sníženou toxicitu související s režimem a regresi onemocnění zprostředkovanou štěpem. V některých studiích pacienti vykazují období smíšeného chimérismu dárce/hostitel, ve kterém je infuze dárcovských lymfocytů spojena s dosažením úplného chimérismu dárce.

Ačkoli toxicita související s režimem je snížena po redukovaných intenzivních přípravných režimech, reakce štěpu proti hostiteli a oportunní infekce zůstávají významným zdrojem morbidity a mortality po nemyeloablativní alogenní transplantaci. Dopad nemyeloablativní transplantace na imunologickou rekonstituci nebyl plně definován. Přetrvávání buněk prezentujících antigen hostitele v období po transplantaci může zvýšit výskyt GVHD v důsledku prezentace aloantigenů dárcovským T buňkám. Naproti tomu reziduální hostitelská buněčná imunita může poskytnout zvýšenou ochranu proti infekčním patogenům a umožnit rychlejší vzdělávání dárcovských lymfocytů. Je třeba poznamenat, že infekce CMV zůstávají v této populaci běžné, ale objevují se později v potransplantačním období charakteristicky po dosažení plného dárcovského chimérismu.34

Nemyeloablativní alogenní transplantace ve spojení s terapií CAMPATH Jedním z přístupů ke snížení výskytu GVHD po nemyeloablativní transplantaci je přidání CAMPATH do preparativního režimu k vyčerpání T buněk jak z příjemce, tak z příchozího štěpu.35 CAMPATH-1H (Alemtuzumab) je rekombinantní DNA odvozená humanizovaná monoklonální protilátka namířená proti buněčnému povrchovému glykoproteinu, CD52; produkované v suspenzi savčích buněk (vaječník čínského křečka).36-39 Campath-1H je indikován k léčbě chronické lymfocytární leukémie B-buněk u pacientů, kteří byli léčeni alkylačními látkami a u kterých selhala léčba fludarabinem. Campath-1H byl použit u pacientů s autoimunitní neutropenií, non-Hodgkinovým lymfomem, revmatoidní artritidou a vaskulitidou. Používá se také k prevenci reakce štěpu proti hostiteli u pacientů po transplantaci kmenových buněk. Profylaxe GVHD byla prováděna samotným cyklosporinem A.

Mackinnon et al zkoumali nemyeloablativní režim přípravy u 47 pacientů s hematologickými malignitami, kteří dostávali alogenní kmenové buňky kostní dřeně od shodných, nepříbuzných dárců.40 Většina pacientů měla vysoce rizikové rysy, včetně selhání předchozí transplantace (29 jedinců). Dvacet transplantátů se neshodovalo pro alely HLA třídy I a/nebo třídy II. Přidali CAMPATH-1H k preparativnímu režimu fludarabinu a melfalanu a podávali buď GCSF mobilizované kmeny periferní krve nebo nemanipulovanou kostní dřeň od odpovídajících nepříbuzných dárců. Primární selhání štěpu se vyskytlo pouze u 2 ze 44 hodnotitelných pacientů (4,5 %). Studie chimérismu u 34 pacientů ukázaly, že většina (85,3 %) dosáhla počátečního úplného dárcovského chimérismu. Pouze u 3 pacientů se vyvinula akutní GVHD stupně III až IV a u žádného pacienta se dosud nevyvinula chronická rozsáhlá GVHD. Odhadovaná pravděpodobnost úmrtnosti bez relapsu v den 100 byla 14,9 % (95% interval spolehlivosti [CI], 4,7 %-25,1 %). Při střední době sledování 344 dní (rozmezí 79–830) bylo celkové přežití a přežití bez progrese po 1 roce 75,5 % (95% CI, 62,8 %–88,2 %) a 61,5 % (95 % CI, 46,1 %-76,8 %), respektive. Následně bylo oznámeno, že významná podskupina pacientů prokázala reaktivaci CMV.41 Přítomnost CMV však neměla negativní dopad na přežití. Zatímco výzkumníci zaznamenali potřebu delšího sledování této kohorty, cítili, že tento přípravný režim zahrnující in vivo CAMPATH-1H byl spojen s trvalým přihojením a minimální toxicitou související s léčbou.

Imunitní rekonstituce po alogenní transplantaci Alogenní transplantace je spojena s obdobím imunitní dysfunkce, která charakteristicky přetrvává alespoň 1 rok po transplantaci.42,43 Imunitní obnova je závislá na rekonstituci prvků humorální a buněčné imunity a jejich reedukaci u příjemce transplantátu. Zvláště se opožďuje u příjemců nepříbuzného štěpu nebo štěpu zbaveného T buněk. Období po transplantaci je charakterizováno sníženými hladinami pomocných T lymfocytů, s tím související inverzí poměru C4:CD8 a zeslabením odpovědí T lymfocytů na mitogenní stimuly a vybavovací antigeny.44-46 Humorální imunitní dysfunkce je spojena se ztrátou ochranných hladin protilátek proti bakteriálním a virovým patogenům, sníženými hladinami cirkulujících imunoglobulinů, zejména podtypu IgG2, a sníženou složitostí ve vzoru přeuspořádání genu pro imunoglobulin.47,48

Dendritické buňky a imunitní rekonstituce Povaha obnovy buněk prezentujících antigen, jako jsou dendritické buňky, pravděpodobně hraje zásadní roli v rekonstituci potransplantační imunity a tolerance hostitele/dárce. Dendritické buňky (DC) tvoří komplexní síť buněk prezentujících antigen, které hrají zásadní roli při indukci primární imunity a také modulaci tolerance.49.50 DC jsou nejúčinnější buňky prezentující antigen a jsou jedinečně schopné indukovat primární imunitní reakce proti novým antigenům prostřednictvím bohaté exprese kostimulačních a adhezních molekul. DC generované z nemyeloidních linií nebo v nezralém stavu mohou zprostředkovat imunitní toleranci a řídit reakce T buněk směrem k fenotypu TH2. V periferní krvi byly identifikovány odlišné populace DC, které se odlišují přítomností myeloidních (CD11c) nebo plazmacytoidních (CD123) markerů.51,52 DC2 (plasmacytoidní) buňky jsou charakterizovány expresí cytokinů typu 2 a tak iniciují Th2 odpověď, zatímco DC1 (myeloidní) buňky iniciují Th1 cytokinovou odpověď. DC izolované od pacientů s maligním onemocněním vykazují funkční nedostatky, které potenciálně přispívají k nedostatečnému rozpoznání nádoru imunitou hostitele. Málo je známo o přihojení DC nebo o fenotypových a funkčních charakteristikách po alogenní transplantaci. Interakce DC s efektorovými populacemi budou pravděpodobně jedinečné po nemyeloablativním kondicionování vzhledem k přítomnosti smíšeného chimérismu dárce/příjemce, který může charakterizovat posttransplantační období.

Na myším modelu Shlomchik et al prokázali, že perzistence hostitelských buněk prezentujících antigen po transplantaci byla spojena s rozvojem GVHD.53 V tomto modelu hostitelské DC schopné prezentovat minoritní histokompatibilní antigeny infundovaným dárcovským T-buňkám potenciálně iniciují aktivaci T-buněk a asociovanou Th-1 cytokinovou kaskádu implikovanou v patogenezi aGVHD. Relativní hladiny podskupin DC1/DC2 v hematopoetickém štěpu silně korelují s výskytem reakce štěpu proti hostiteli a výskytem relapsu. Mobilizace kmene zprostředkovaná G-CSF je spojena se zvýšenými hladinami populací DC2.54 Na zvířecím modelu byla infuze splenocytů a kostní dřeně od dárců léčených G-CSF spojena se vznikem fenotypu DC2, a tedy s tolerancí.55 V jedné studii pacientů podstupujících alogenní transplantaci byla přítomnost zvýšeného počtu buněk DC2 v hematopoetickém štěpu spojena s poklesem GVHD a zvýšením relapsu a horšími výsledky.56 Dopad DC chimérismu, vzorce rekonstituce a přítomnost populací DC1 a DC2 po nemyeloablativní alogenní transplantaci nebyl dostatečně studován. Nedávné studie ukázaly, že CD52 je exprimován některými populacemi DC a naznačují, že terapie CAMPATH může ovlivnit prezentaci antigenu vyčerpáním populace DC z hostitele.57-59 Deplece DC derivovaných z hostitele může snížit výskyt GVHD, zatímco přítomnost dárcovských DC je pravděpodobně nezbytná pro rekonstituci buněčné imunity.

V navrhované studii máme v úmyslu prozkoumat aplikaci preparativního režimu založeného na CAMPATH u pacientů s hematologickými malignitami podstupujících nemyeloablativní alogenní transplantaci kmenových buněk od nepříbuzného dárce. Studie bude zahrnovat pacienty, kteří by jinak nebyli kandidáty na konvenční myeloablativní kondicionační režim z důvodu věku nebo orgánové dysfunkce a kteří nemají sourozenecké dárce odpovídající HLA. Bude také zahrnovat pacienty trpící lymfoidními malignitami, jako je lymfom nízkého stupně, CLL a mnohočetný myelom, u kterých došlo při konvenční alogenní transplantaci k nepřijatelně vysoké úmrtnosti související s transplantací. Zahrnutí myeloidních i lymfoidních hematologických malignit do studované kohorty optimalizuje přírůstek a neomezí schopnost dosahovat cílů studie. Vzorce přihojení štěpu, reakce štěpu proti hostiteli, imunitní rekonstituce a chimérismus dárce/hostitel jsou primárně určeny preparativním režimem a transplantační strategií a neměly by se v rámci kohorty pacientů výrazně lišit.

Jako přípravný režim jsme zvolili střední dávku cyklofosfamidu a fludarabinu ve snaze minimalizovat výskyt rejekce štěpu bez zvýšení frekvence morbidity a mortality související s léčbou. Na základě práce MacKinnona et al přidáme CAMPATH-1H do preparativního režimu, abychom dále snížili výskyt GVHD a podpořili přihojení dárcovských kmenových buněk. Po tomto režimu jsou cirkulující hladiny CAMPATH přítomny několik týdnů po transplantaci a mohou nadměrně vyčerpat dárcovské T buňky a také eliminovat populace DC z dárcovského štěpu. Ve snaze zlepšit potransplantační imunitní rekonstituci a omezit rizika infekce a relapsu jsme zvolili nižší dávku CAMPATH a budeme sledovat hladiny v sériových časových bodech po transplantaci.

Hlavní koncové body studie budou zahrnovat definování: 1) profilu toxicity souvisejícího s léčbou a potransplantační hematopoetické obnovy 2) incidence a závažnosti CMV infekce a akutní a chronické GVHD 3) fenotypových a funkčních charakteristik populací DC a T buněk po transplantaci; a 4) vzory chimérismu dárce/hostitel v populacích DC a T buněk a jeho korelace s GVHD. Jako sekundární cílový bod bude stanoven 1 a 2letý DFS a OS.