Studio prospettico per valutare le prestazioni mediche della mappatura ottica e del sequenziamento a lettura lunga nel rilevamento di anomalie cromosomiche numeriche e strutturali. Mappatura e sequenziamento dei cromosomi (CHROMAPS)

Le aberrazioni cromosomiche si trovano fino all'1% della popolazione generale. Le aberrazioni strutturali, sia bilanciate (3,6‰) che sbilanciate (0,9‰), ne rappresentano un terzo. La maggior parte (ma non tutte) le anomalie squilibrate sono associate a un fenotipo rilevante, mentre la maggior parte (ma non tutte) i riarrangiamenti bilanciati non hanno conseguenze sul fenotipo ad eccezione di possibili disturbi riproduttivi. Infatti, la prevalenza di quest'ultimo tra gli individui infertili è dieci volte superiore rispetto alla popolazione fertile. Inoltre, il 6% - 27% dei riarrangiamenti apparentemente equilibrati può portare a disturbi dello sviluppo attraverso vari meccanismi.

I metodi di analisi cromosomica di primo livello, il cariotipo e l'analisi dei microarray cromosomici (CMA), sono ostacolati da una bassa risoluzione (cariotipo) o dalla loro incapacità di rilevare riarrangiamenti bilanciati (CMA). Tuttavia, il cariotipo è ancora l'analisi gold standard in caso di disturbi riproduttivi (RD) e aborti ricorrenti a causa dell'elevata prevalenza di aneuploidie (principalmente aneuploidie dei cromosomi sessuali, cioè 45, X o 47, XXY) o anomalie strutturali equilibrate.

Secondo un'indagine annuale nazionale francese condotta dall'Agence de la Biomedecine, la resa diagnostica è di ~ 5%-10% per il cariotipo in RD e ~ 15-20% per APLV in ID/MCA. Pertanto, molti pazienti rimangono senza una diagnosi molecolare della loro condizione dopo questi studi di primo livello. Il sequenziamento dell'intero esoma e ora il sequenziamento dell'intero genoma hanno dimostrato di essere in grado di aumentare la resa diagnostica fino al 50-60% nei pazienti con ID. Tuttavia, gli attuali metodi di sequenziamento a lettura breve non sono in grado di fornire dati affidabili per il rilevamento della variazione strutturale (SV), a causa dell'incapacità degli strumenti bioinformatici di mappare correttamente le sequenze a causa dell'elevata percentuale di sequenze omologhe ai breakpoint SV. Nuove metodologie emergenti basate su lunghi frammenti di DNA sono ora disponibili e possono fornire un modo per aggirare le attuali limitazioni: sequenziamento a lettura lunga (lrNGS) e mappatura ottica del genoma (OGM):

OGM è stato sviluppato da Bionano Genomics e combina la microscopia microfluidica e ad alta risoluzione per offrire un'immagine di lunghe molecole di DNA ad alto peso molecolare (fino a più di 1 Mb) etichettate con specifici tag di sequenza. Da queste immagini è possibile eseguire un assemblaggio de novo del genoma di qualsiasi paziente e confrontarlo con una mappa del genoma di riferimento per svelare tutti i tipi di riarrangiamenti strutturali con una risoluzione da 100 a 1000 volte superiore rispetto al cariotipo. Una seconda pipeline basata sulla copertura in ciascuna regione consente il rilevamento di grandi CNV e aneuploidie.

lrNGS di lunghi frammenti di DNA (diversi kb) riduce i problemi di assemblaggio basati su sequenziamento a lettura breve dovuti a sequenze ripetitive e consente il rilevamento di tutte le mutazioni, da SNV a SV e CNV. A causa delle grandi dimensioni degli inserti di frammento, sono previsti meno falsi positivi per la chiamata SV rispetto a quanto osservato con il sequenziamento di lettura breve o di lettura collegata. Sebbene le pipeline bioinformatiche stiano migliorando, il rilevamento prospettico di SV/SNV di grandi dimensioni rimane impegnativo, con un tasso molto elevato di falsi positivi e falsi negativi. Inoltre, non è stato condotto nessuno studio per testare in modo prospettico la fattibilità e l'efficienza medica dell'utilizzo del sequenziamento a lettura lunga come test all-in-one di primo livello per l'identificazione di SV e CNV.

Obiettivo primario L'obiettivo principale di questo studio prospettico è confrontare il tasso di diagnosi di OGM (Bionano®) e lrNGS (Nanopore®) con quello delle tecnologie standard di cura, ad es. cariotipo per pazienti che presentano disturbi riproduttivi (amenorrea primaria, insufficienza ovarica precoce, grave oligozoospermia, azoospermia) o APLV in caso di disturbi dello sviluppo (ID/MCA).

Obiettivi secondari Affinare i dati sull'incidenza e il tipo di aberrazioni cromosomiche nelle diverse categorie cliniche di pazienti Valutare i limiti di Bionano® e Nanopore® Valutare l'impatto del rilevamento potenziato di anomalie subcromosomiche da parte di Bionano® o Nanopore® sulla cura medica del paziente Confrontare il rapporto costo-efficacia di entrambi gli approcci

Tipo di studio Si tratta di uno studio prospettico di coorte multicentrico nazionale che coinvolge 11 centri citogenetici costituzionali certificati francesi. Agli stessi pazienti verrà offerta l'analisi dell'intero genoma utilizzando tecniche standard (Karyotyping o CMA a seconda del motivo del rinvio) e due nuovi metodi di analisi dell'intero genoma, OGM (Bionano®) e lrNGS (Nanopore®).