Caratterizzazione genetico-molecolare in pazienti sottoposti a infusione di cellule CAR-T (CAR_22)

Negli ultimi anni, l'applicazione di metodiche sempre più avanzate di coltura cellulare ex-vivo e ingegneria cellulare ha permesso di sviluppare nuove piattaforme terapeutiche cellulari tra cui la "CAR (Chimeric Antigen Receptor) - T cell therapy". La terapia cellulare CAR-T è una terapia che utilizza linfociti T ingegnerizzati per esprimere un recettore chimerico diretto contro un antigene specifico, teoricamente applicabile al trattamento di tutte le neoplasie ma attualmente più ampiamente utilizzata nel trattamento delle neoplasie ematologiche. Uno degli aspetti più innovativi introdotti con la terapia cellulare CAR-T è quello dei living-drug, cellule che fungono da farmaco oltre che da mezzo per costruire un'immunità specifica contro la neoplasia.

Il programma di terapia cellulare CAR-T si articola in tre punti fondamentali:

• la raccolta dei linfociti (per aferesi) destinati al processo di ingegnerizzazione;
• la fabbricazione finalizzata alla trasduzione e all'espansione dei linfociti raccolti;
• l'infusione di prodotto cellulare dopo chemioterapia linfodepletiva.

I vantaggi di questa terapia sono quindi rappresentati dalla possibilità di rifornire l'immunità del paziente, carente nel controllo della malattia neoplastica, con linfociti in grado di esprimere un'attività antineoplastica con meccanismi non soggetti a restrizione del riconoscimento antigenico HLA-mediato.

Attualmente l'autorizzazione all'immissione in commercio (MA) nell'Unione Europea e in Italia prevede l'utilizzo di terapie con cellule CAR-T anti-CD19 basate su costrutti chimerici di seconda generazione:

• tisagenlecleucel (Kymriah): pazienti pediatrici e giovani adulti fino a 25 anni di età inclusi con leucemia linfoblastica acuta (LLA) a cellule B refrattaria, recidivante post-trapianto o in seconda o ulteriore recidiva; pazienti adulti con linfoma diffuso a grandi cellule B recidivato o refrattario (DLBCL) dopo due o più linee di terapia sistemica; pazienti adulti con linfoma follicolare (LF) recidivante o refrattario dopo due o più linee di terapia sistemica.
• axicabtagene ciloleucel (Yescarta): pazienti adulti con linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) e linfoma primario del mediastino a grandi cellule B refrattario o recidivante (PMBCL), dopo due o più linee di terapia sistemica; pazienti adulti con linfoma follicolare (FL) refrattario o recidivato dopo tre o più linee di terapia sistemica.
• brexucabtagene autoleucel (Tecartus): pazienti adulti con malattia del mantello del linfoma cellulare (MCL) recidivante o refrattario dopo due o più linee di terapia sistemica comprendente un inibitore della tirosina chinasi di Bruton. L'autorizzazione all'immissione in commercio per lisocabtagene maraleucel (Breyanzi) è attesa a breve per il trattamento del linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL), del linfoma primitivo del mediastino a grandi cellule B (PMBCL) e del linfoma follicolare (LF) di grado 3B, refrattario o recidivante.

Tuttavia, l'uso delle terapie CAR-T non è esente da eventi avversi potenzialmente gravi e talvolta letali; nel profilo di tossicità sono riconoscibili come peculiari:

• sindrome da rilascio di citochine (CRS)
• Aplasia delle cellule B (ipogammaglobulinemia)
• reazioni avverse neurologiche
• tossicità ematologica
• infezioni. Pertanto, considerato che da un lato gli eventi avversi non sono trascurabili e dall'altro che una percentuale > 50% dei pazienti perde la risposta ottenuta, è necessario migliorare il profilo terapeutico della terapia cellulare CAR-T aumentandone l'efficacia e riducendone la tossicità. Entrambe queste strategie sono legate alla comprensione dei meccanismi di resistenza delle cellule neoplastiche, nonché alla biologia delle cellule CAR-T e di tutti i sistemi cellulari (microambiente) e non cellulari con cui interagiscono.

L'importanza dello studio risiede nelle indagini volte a comprendere le possibili strategie che consentono alla cellula neoplastica di eludere i meccanismi di citotossicità mediata da CAR-T e/o di alterare la struttura dell'antigene, rendendolo funzionalmente "invisibile" all'interazione con l'auto ; sarà così possibile identificare meccanismi di resistenza al trattamento con cellule CAR-T. Un altro punto di forza dello studio è rappresentato dal sequenziamento di singole cellule per identificare sottopopolazioni di cellule linfoidi (CAR+ e CAR-) e mieloidi correlate all'esito clinico (tossicità e risposta al trattamento).

Pertanto, gli obiettivi primari dello studio sono:

• Studi genomici su campioni di sangue periferico prelevati da pazienti affetti da neoplasie ematologiche sottoposti a terapia cellulare CAR-T, al fine di identificare correlazioni tra firme cellulari neoplastiche e risposta alla terapia (valutata secondo standard di laboratorio e strumentali).
• Studio di popolazioni linfoidi CAR+ e CAR- e di popolazioni mieloidi con piattaforme di sequenziamento di RNA unicellulare in campioni di sangue periferico al fine di comprendere le dinamiche cellulari correlate a esiti clinici quali risposta alla terapia (valutata secondo standard di laboratorio e strumentali) e reazioni avverse eventi (CRS, ICANS, sHLH, coagulopatia, citopenie e discrasie autoimmuni).

Il profilo tumorale risulterà nella cinetica della frequenza allelica dei geni specifici delle varianti (VAF) (identificati mediante sequenziamento NGS del DNA libero circolante) in pazienti con esito clinico diverso (risposta o refrattarietà al trattamento con terapia CAR-T). Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) produrrà valori di abbondanza genica e cluster cellulari (sottopopolazioni di cellule linfoidi CAR+ e CAR- e cellule mieloidi) in concomitanza di eventi considerati rilevanti nella storia clinica del paziente, come il verificarsi di tossicità e la perdita o il mantenimento di risposta al trattamento, al fine di stabilire le possibili correlazioni.

Lo studio sarà proposto a tutti i pazienti di età ≥ 18 anni sottoposti a infusione di cellule CAR-T presso il Programma Dipartimentale di Terapie Cellulari Avanzate dell'IRCCS AOU di Bologna, circa 50 pazienti all'anno per un totale di 150 pazienti.

I campioni di sangue periferico verranno utilizzati per eseguire lo studio saranno prelevati nei seguenti orari:

• all'aferesi;
• all'ingresso in reparto;
• al giorno -1;
• il giorno 0 (2 ore dopo l'infusione);
• al giorno +1, +3, +5, +7, +9, +11, +13, +30, +90, +180, +365;

Il prelievo dei tessuti coincide con i prelievi che rappresentano lo standard attuale nella pratica clinica di routine nel paziente sottoposto a terapia CAR-T:

i prelievi saranno ottenuti senza inficiare le procedure assistenziali (diagnostico-terapeutiche) regolarmente programmate.