Utilità diagnostica del DNA libero da cellule del Mycobacterium Tuberculosis a Hong Kong (MYDNITE-3)

La tubercolosi (TBC) rimane una delle principali malattie infettive a livello globale. Secondo il Global TB Report dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) nel 2023, oltre sette milioni di persone sono state infettate dalla tubercolosi nel 2022 e 1,3 milioni sono morte a causa della malattia. La Cina è tra i primi tre paesi con il più alto tasso di tubercolosi, mentre Hong Kong ha un tasso intermedio di tubercolosi, con una media di 4.000 nuovi casi all’anno.

L'infezione da tubercolosi può causare malattie con varie manifestazioni al di fuori del parenchima polmonare in circa il 25% dei pazienti (TBC extrapolmonare, EPTB) ed è associata a esiti terapeutici peggiori rispetto alla tubercolosi polmonare. La pleurite tubercolare (TBP) è la forma più diffusa a Hong Kong e in Cina (dal 41% al 50% di tutti gli EPTB). Sebbene il TBP possa presentarsi con episodi da acuti a subacuti di versamento pleurico unilaterale, dispnea e febbre, la sua presentazione è spesso aspecifica. Data la sua importanza clinica ed epidemiologica, discriminare accuratamente il TBP da altri tipi di versamento pleurico è fondamentale per abbreviare il processo diagnostico e ottimizzare i risultati per questi pazienti.

Sfide di laboratorio per la diagnosi di TBP La diagnosi di TBP è impegnativa poiché la malattia è causata da un piccolo numero di batteri (di natura paucibacillare) nello spazio pleurico, che limita le prestazioni diagnostiche di varie modalità diagnostiche convenzionali. Queste limitazioni includono la bassa sensibilità per i test microbiologici sul liquido pleurico (colorazione dei bacilli acido-resistenti [AFB], coltura del Mycobacterium tuberculosis [MTB] e reazione a catena della polimerasi [PCR] MTB) e la mancanza di specificità per i biomarcatori del liquido pleurico (adenosina deaminasi [ADA]) soprattutto nelle regioni a bassa prevalenza di tubercolosi. Sebbene i risultati della coltura MTB e della PCR sul tessuto pleurico siano più elevati, la biopsia pleurica (mediante procedura al letto del paziente o pleuroscopia) comporta un'invasività e richiede una procedura aggiuntiva. Attualmente, nessun test ideale può raggiungere più obiettivi diagnostici contemporaneamente, tra cui un’elevata sensibilità di rilevamento, un’elevata specificità per escludere altre malattie, tempi di risposta brevi, bassa invasività e rilevamento della resistenza ai farmaci. La diagnosi di TBP si basa praticamente su un insieme di endpoint clinici, radiologici e di laboratorio. La diagnosi può occasionalmente essere stabilita clinicamente senza alcuna prova microbiologica o istologica (probabile TBP).

Conseguenze di una diagnosi ritardata di TBP I principali svantaggi clinici della difficoltà nella diagnosi di TBP includono interventi pleurici invasivi non necessari e un ritardo nell'inizio del trattamento curativo. Il nostro audit interno ha recentemente rivelato che l’inizio del trattamento è stato ritardato in attesa dei risultati dei test di conferma e che i pazienti hanno richiesto in media una procedura aggiuntiva per stabilire la diagnosi, che includeva la biopsia pleurica di natura più invasiva. Questi pazienti hanno avuto lunghe degenze ospedaliere per accertamenti e sperimentazioni con più antibiotici per la febbre irrisolta. Alcuni pazienti potrebbero invece ricevere un trattamento anti-TB empirico basato su presentazioni cliniche compatibili senza risultati di indagini diagnostiche di conferma. Tuttavia, ciò non è privo di rischi (ad es. epatotossicità), soprattutto negli anziani, che sono più suscettibili al TBP. Uno strumento diagnostico migliore per il TBP attenuerebbe queste sfide cliniche.

Biopsia liquida nel versamento pleurico: ultimo sviluppo del nostro gruppo La biopsia liquida rilevando il DNA libero da cellule (cfDNA) nei fluidi corporei è una potenziale soluzione. Quando i batteri della tubercolosi muoiono o si decompongono, i frammenti di DNA si diffondono nello spazio pleurico, formando Mycobacterium tuberculosis cfDNA (MTB cfDNA). Il rilevamento del cfDNA dell’MTB nel liquido pleurico può dimostrare direttamente la presenza dei bacilli della tubercolosi o delle loro subunità nello spazio pleurico, il che rappresenta un’opzione interessante. Studi precedenti avevano utilizzato il cfDNA di MTB per diagnosticare il TBP, ma la prestazione era variabile. Che e colleghi hanno misurato per primi il cfDNA dell'MTB rilevando la sequenza di inserzione IS6110. La sensibilità della diagnosi di TBP è stata del 75,0% (intervalli di confidenza al 95% [CI] 63,7-86,3%) con specificità al 100,0% (IC 95% 100,0-100,0%), e i casi negativi alla coltura MTB del liquido pleurico sono stati inclusi nel gruppo TBP. La sensibilità diagnostica del cfDNA dell'MTB era migliore dell'ADA del liquido pleurico, della coltura dell'MTB e della PCR dell'MTB mediante Xpert MTB/RIF. Yang et al hanno utilizzato la stessa tecnica di laboratorio e hanno riscontrato un'elevata sensibilità diagnostica pari al 96,6% (95% CI 92,0-100,0%) nei casi di TBP definiti da MTB del liquido pleurico o stato positivo per PCR. Tuttavia, la sensibilità diagnostica è scesa al 79,5% (IC 95% 72,4-86,7%) se nel gruppo TBP sono stati inclusi la coltura MTB del liquido pleurico o i casi negativi alla PCR. Risultati simili sono stati riportati anche da Sharma et al. Tutti i risultati di questi studi riflettono le prestazioni diagnostiche eterogenee del cfDNA di MTB. Una coltura MTB del liquido pleurico o uno stato PCR negativi, che indicano una bassa carica batterica, possono compromettere l'utilità clinica del cfDNA MTB.

Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un nuovo test di laboratorio che misura i livelli di MTB cfDNA, coinvolgendo il sequenziamento mirato attraverso un sistema di sonde di cattura e un nuovo algoritmo bioinformatico. La prestazione diagnostica è rimasta solida anche se sono stati inclusi casi negativi alla coltura di MTB del liquido pleurico, il che può potenzialmente ovviare a un'altra procedura diagnostica invasiva.

Necessità di una coorte di validazione prima dell'introduzione nella pratica clinica Poiché la coorte di sviluppo contiene solo un numero limitato di campioni di liquido pleurico con diagnosi definitive, la vera accuratezza diagnostica del nuovo test MTB cfDNA può essere determinata solo in una coorte prospettica e non selettiva che riflette la situazione del mondo reale, che fornirà una prestazione diagnostica realistica. Ciò confermerà l'utilità clinica del test MTB cfDNA prima di essere introdotto nella pratica clinica. Ipotizziamo che il nuovo test MTB cfDNA rimanga robusto in una coorte prospettica e surclassi i metodi precedentemente riportati nel discriminare i versamenti pleurici dovuti a TBP da quelli non-TBP.