Esplorare il livello di espressione della proteina caderina 6 (CDH6) nei campioni tumorali ossei maligni primari e la sua applicazione clinica nella valutazione della prognosi

1. Valutare la fattibilità dell'uso dell'immunoistochimica per rilevare il livello di espressione di CDH6 nelle diapositive bianche istologiche di pazienti con osteosarcoma e sarcoma di Ewing come marcatore biologico per il monitoraggio prognostico della visita iniziale del paziente è stata clinicamente diagnosticata come osteosarcoma di alto livello o sarcoma di Ewing. Il modulo di consenso informato per il monitoraggio dei campioni è stato firmato per primo. Durante la biopsia della puntura, sono stati presi il tessuto fresco (componente del tessuto molle, non il tessuto osseo) con un volume di circa 1 cm3, fissati con soluzione di formalina e fette di tessuto (fette bianche) con uno spessore di 5 micron sono stati tagliati, imbrattati e cotti. La colorazione immunoistochimica è stata utilizzata per l'analisi dell'espressione di CDH6 (XP) ® Cadherin-6 (D3T3i) coniglio MAB Cat:#48111, tecnologia cellcellino ）。

2. Processo di trattamento e follow-up Il regime di chemioterapia neoadiuvante di routine per l'osteosarcoma nel nostro centro include l'uso sequenziale di cisplatino, doxorubicina ad alte dosi, metotrexato e ifosfamide, mentre il regime VDC-ie viene usato per il sarcoma di ewing (vedi Figura 3.1.1a, B per i dettagli). A causa della significativa eterogeneità delle cellule di osteosarcoma, le sottopopolazioni delle cellule colpite da ciascun farmaco non sono le stesse e ci sono anche differenze nelle sottopopolazioni di cellule necrotiche e lisate dopo i farmaci. Il livello di espressione di CDH6 nelle fette di tessuto paziente cambierà dinamicamente con la sensibilità della chemioterapia. Durante la conduzione di valutazioni cliniche, se data l'opportunità, cercheremo di confrontare i cambiamenti nei livelli di CDH6 nelle sezioni tissutali per valutare il loro valore per il monitoraggio dell'efficacia.

   I pazienti di solito subiscono un trattamento chirurgico dopo chemioterapia neoadiuvante e il carico tumorale diminuisce nettamente dopo l'intervento chirurgico. Il campione di tumore lordo ottenuto durante l'intervento chirurgico deve essere trattenuto con campioni di tessuto tumorale qualificato (almeno 1 cm3 di volume). Durante il processo di trattamento del tumore, se esiste un'opportunità di intervento chirurgico, la biopsia o la resezione del tessuto tumorale devono essere nuovamente eseguite per monitorare i cambiamenti nei livelli di espressione di CDH6. La valutazione clinica del trattamento tumorale deve essere condotta ogni due mesi fino alla fine dello studio o della morte del paziente.

   L'intero studio include un periodo di screening, una raccolta di sangue e un periodo di ritenzione dei campioni e un periodo di follow-up. Tutti i partecipanti allo studio devono soddisfare tutti i criteri di inclusione ed esclusione.

   Durante il periodo di screening, i potenziali partecipanti subiranno una valutazione di ammissibilità per lo studio dopo aver firmato il modulo di consenso informato. I soggetti devono essere sottoposti a valutazione radiografica della malattia entro 14 giorni prima della chemioterapia neoadiuvante, tra cui la TC migliorata o la risonanza magnetica del sito tumorale primario, la CT a scansione della pianura toracica, l'imaging osseo per tutto il corpo e il PET/CT di tutto il corpo.

   I soggetti riceveranno la chemioterapia e il trattamento chirurgico in base alla routine di diagnosi e trattamento e al momento dei nodi progettati nell'esperimento, prima e dopo la routine e la chirurgia di routine dei soggetti, il dipartimento di patologia prenderà 3 vetrini bianchi, ciascuno misura 4 micron, striscia e gel di forcella e eseguirà un gel immunoistochimico.

   Durante il periodo di follow-up, i soggetti hanno completato la chemioterapia e il trattamento chirurgico, ma riceveranno comunque un follow-up sul loro stato di sopravvivenza e sullo stato di oncologia e tutto il follow-up sarà un trattamento di routine nel nostro centro.

3. Useremo campioni di tessuto tumorale FFPE per la colorazione immunoistochimica per analizzare l'espressione di CDH6, β - catenina e CDH17 nel tessuto tumorale.

Colorazione immunoistochimica:

Anticorpo primario: anticorpo monoclonale di coniglio CDH6 (D3T3I); anticorpo monoclonale di coniglio di catenina (D10A8); Anticorpo monoclonale di topo CDH17 (anticorpo interno di Xianxiang); Sistema di rilevamento degli anticorpi secondari: kit di rilevamento del polimero di legame ； diluente anticorpo: CST, 8112L,#38 ； Foto positive: sezioni FFPE di linee cellulari a bassa, media e ad alta espressione; Il programma di colorazione utilizza il metodo stabilito di Xianxiang.

Interpretazione patologica:

Utilizzare il punteggio H per l'analisi semitativa semi. Il punteggio H è la somma della percentuale di colorazione cellulare moltiplicata per i valori di intensità corrispondenti (0 = negativo, 1 = 1+, 2 = 2+, 3 = 3+), che varia da 0 a 300.

L'interpretazione dei valori di intensità di colorazione delle cellule tumorali è la seguente:

Alta espressione (3+): una forte colorazione della membrana cellulare e/o colorazione citoplasmatica sono stati osservati nell'amplesso X4; Espressione moderata (2+): la colorazione della membrana cellulare è stata osservata in ingrandimento X10 o X20; Bassa espressione (1+): colorazione con membrana cellulare debole e/o colorazione citoplasmatica sono stati osservati in ingrandimento X40; Negativo (0): non è stata osservata la colorazione della membrana cellulare e/o la colorazione citoplasmatica nelle cellule tumorali.