Confronto tra la terapia fotodinamica topica e il calcipotriolo topico nella gestione della leucoplachia orale (PDT CALCI HOL)

Obiettivi

Obiettivi Primari:

3.1 Confrontare l'effetto della terapia fotodinamica topica mediata da blu di toluidina al 2,5% e del calcipotriolo topico (0,005%) sulla risposta clinica dopo il completamento del trattamento a 4 settimane dal basale durante la gestione della leucoplachia orale

Obiettivi Secondari:

3.2 Confrontare l'effetto della terapia fotodinamica topica mediata da blu di toluidina al 2,5% con il calcipotriolo topico (0,005%) sulla dimensione della lesione, rugosità/bianchezza della lesione e qualità di vita orale dopo il completamento del trattamento a 4 settimane e 12 settimane dal basale durante la gestione della leucoplachia orale 3.3 Confrontare l'effetto della terapia fotodinamica topica mediata da blu di toluidina al 2,5% con il calcipotriolo topico (0,005%) sui marcatori molecolari salivari (IL6, TNF-α, PCNA, Survivin e VEGF) dopo il completamento del trattamento a 4 settimane dal basale 3.4 Confrontare gli eventi avversi, il tempo per la risposta completa e i tassi di recidiva tra i due gruppi

Razionale:

Quasi due terzi dei tumori orali sono preceduti da disturbi potenzialmente maligni orali come la leucoplachia orale, causati da abitudini al tabacco, alcol e noce di areca. La leucoplachia orale ha un'alta prevalenza e tasso di trasformazione maligna (0,13%-40,8%). Non esistono protocolli di gestione universali per la leucoplachia orale. Gli interventi preventivi, conservativi, medici e chirurgici presentano diverse limitazioni e alti tassi di recidiva. Le leucoplachie orali non omogenee, displastiche, grandi, multifocali, proliferative recidivanti e recalcitranti in soggetti con comorbidità pongono sfide ancora più serie nella gestione per il medico orale che spesso ricorre a misure conservative con osservazione vigile. I pazienti con leucoplachia orale devono affrontare l'aspetto antiestetico della lesione e la paura della malignità che influiscono sulla loro salute orale e psicologica.

Si ritiene che la rimozione delle lesioni patologiche di leucoplachia orale riduca il rischio di malignità. Sono disponibili opzioni chirurgiche, ablazione laser, elettrocauterizzazione, crioterapia, ma sono associate a complicanze post-operatorie come dolore, gonfiore, infezioni, neuropatia, cicatrizzazione e influenzano negativamente la funzione orale con alti tassi di recidiva. Questi metodi affrontano solo l'area fisica anormale dove sono istituiti e non apportano alcun cambiamento benefico nella biologia dell'area interessata. C'è bisogno di metodi non invasivi per rimuovere la leucoplachia orale senza le attuali limitazioni e che apportino anche cambiamenti molecolari favorevoli nei tessuti sottostanti e adiacenti per mitigare il rischio di trasformazione maligna.

La terapia fotodinamica (PDT) è un metodo non invasivo per rimuovere tessuto anormale utilizzando un fotosensibilizzante (PS) e un'attivazione luminosa appropriata che mira selettivamente alle cellule anormali e causa citotossicità e morte. La PDT causa anche apoptosi, interruzione vascolare e ha effetti immunomodulatori per diminuire il rischio di malignità. Il PS più ampiamente utilizzato e studiato è l'acido 5-aminolevulinico (5-ALA). Il 5-ALA presenta diverse limitazioni in quanto è molto costoso, fotosensibile, causa gonfiore, dolore, sensazione di bruciore, reazione allergica sul tessuto adiacente, richiede una stanza buia per l'applicazione e lunghe ore di incubazione (2 ore). Il blu di toluidina (TB) è un colorante metacromatico che è stato utilizzato come colorante vitale nello screening del cancro orale in quanto colora preferenzialmente le cellule mitotiche e displastiche. Può anche essere utilizzato come PS poiché viene attivato dalla luce rossa (620-660 nm) ed è stato utilizzato nella PDT in una singola serie di casi di 15 lesioni di leucoplachia orale con il 40% di risposta completa. È economico, sicuro, meno tossico e fotosensibile, mira alle cellule anormali, applicazione semplice, richiede meno tempo di incubazione, non necessita di stanza buia e non sono stati segnalati effetti collaterali. La PDT è stata solitamente provata con 5-ALA come fotosensibilizzante (PS) e luce laser come attivatore. La PDT con sorgente luminosa LED come attivatore è più economica e più fattibile in contesti con risorse limitate.

I retinoidi topici sono stati utilizzati come metodo non invasivo per rimuovere le lesioni di leucoplachia orale grazie alla loro attività anticheratinocitica, ma hanno alti tassi di recidiva, rischio di tossicità sistemica e sviluppo di resistenza. Il calcipotriolo topico è un analogo sintetico della vitamina D che è stato utilizzato nella psoriasi per i suoi effetti antiproliferativi, antinfiammatori, antiangiogenici e immunomodulatori. Ci sono solo due studi che hanno utilizzato il calcipotriolo nella leucoplachia orale con risposta completa dal 25% all'80% senza effetti collaterali.

Non esiste attualmente nessuno RCT che abbia confrontato gli effetti della PDT mediata da TB e del calcipotriolo topico nella leucoplachia orale.

I livelli di citochine pro-oncogene (IL6, TNF-α, PCNA, Survivin e VEGF) che promuovono infiammazione, proliferazione e angiogenesi sono importanti biomarcatori prognostici che possono aiutare a valutare i benefici di qualsiasi intervento nella leucoplachia orale. Non ci sono studi che abbiano valutato queste citochine dopo terapia topica con PDT o calcipotriolo nella leucoplachia orale.

Numero di Pazienti:

Dimensione del Campione: In una revisione sistematica e meta-analisi sulla PDT per la leucoplachia orale di Zhang et al (2023) è stata osservata una risposta completa complessiva nel 50% dei pazienti. Mentre solo 2 studi menzionano i risultati del calcipotriolo topico (0,005%) nella leucoplachia orale con una dimensione del campione di 20 in entrambi i gruppi di studio. In un RCT (Femanio et al 2001) che ha riscontrato una risposta completa dell'80% nella leucoplachia orale dopo calcipotriolo topico a 5 settimane. In un altro studio (Galwash et al 2017) in cui la risposta totale era del 25% a 4 settimane. A causa della mancanza e variabilità dei dati negli studi disponibili sulla risposta del calcipotriolo topico (0,005%) nella leucoplachia orale, possiamo anticipare una risposta completa nel 25% dei pazienti nel nostro studio. Dimensione del campione stimata per il confronto a due campioni delle proporzioni Test H0: P1=P2, dove p1 è la proporzione nella popolazione 1 e p2 è la proporzione nella popolazione 2.

Assunzione:

alpha=0,0500 (bilateral) potenza=0,8000 p1=0,2500 p2=0,5000 n2/n1=1,00 Dimensioni del campione richieste stimate: n1=66, n2=66 La dimensione finale del campione era 83/gruppo considerando il 20% dei pazienti persi al follow-up.

Dimensione totale del campione: 166

Gruppo A (n=83): Verrà utilizzata PDT non invasiva utilizzando LED di lunghezza d'onda compresa tra 630-660 nm (Fluenza 15 J/cm²) come sorgente luminosa e TB al 2,5% come fotosensibilizzatore nella leucoplachia orale una volta a settimana per 4 settimane insieme a terapia preventiva e convenzionale.

Gruppo B (n=83): Applicazione topica di unguento di calcipotriolo 0,005% due volte al giorno per 4 settimane insieme a terapia preventiva e convenzionale

5.5 Disegno dello studio Uno studio clinico randomizzato in aperto

Randomizzazione a Blocchi:

La randomizzazione a blocchi con dimensione variabile del blocco verrà eseguita utilizzando numeri casuali generati al computer. Rapporto di allocazione (1:1)

Occultamento dell'Allocazione:

I partecipanti saranno randomizzati utilizzando buste sigillate opache numerate sequenzialmente (SNOSE): il gruppo di randomizzazione sarà scritto su un foglio e conservato in una busta sigillata opaca preparata con un foglio di alluminio e un foglio di carbonio in ciascuna. La busta sarà etichettata con un numero seriale e un codice di randomizzazione e avrà un identificatore dello studio sulla parte anteriore. L'intervento sarà scritto su un foglio all'interno della busta e sigillato dal tecnico. Le buste verranno aperte sequenzialmente dall'operatore e ai pazienti verrà assegnato un braccio di studio in base all'intervento menzionato all'interno della busta. Le buste utilizzate verranno conservate separatamente fino al completamento dello studio.

Intervento

Gestione convenzionale non invasiva (Cura abituale):

Tutti i soggetti nei due gruppi riceveranno la stessa gestione convenzionale standard non invasiva consigliata per la leucoplachia orale secondo le attuali evidenze scientifiche.

• Consulenza comportamentale breve per la cessazione delle abitudini al tabacco, noce di areca e alcol secondo la tecnica 5A e 5R dell'OMS al basale e a ogni follow-up.
• Profilassi orale
• Rimozione dei fattori di irritazione orale come denti taglienti, apparecchi o protesi, terzi molari buccoversi inclusi, abitudini parafunzionali
• Istruzioni per il mantenimento dell'igiene orale
• Controllo delle condizioni sistemiche (anemia, diabete, ipertensione, disturbi tiroidei) mediante rinvio a specialisti
• Rimozione di tutti i fattori predisponenti per l'infezione da candida orale
• Promozione di pratiche sessuali sicure
• Consulenza nutrizionale e dietetica (cibo stagionale e regionale ricco di nutrienti, vitamine, antiossidanti evitando cibi e bevande piccanti/acidi/caldi)
• Sorveglianza regolare per la trasformazione maligna Indagini: Ortotopantomografia, Emocromo completo, Test di funzionalità epatica, Test di funzionalità renale, Profilo lipidico, Ormone paratiroideo, Siero Ca2+, Livello di Vit D3 sierica, Livello di elettroliti sierici Selezione del sito della leucoplachia orale nello studio Nei soggetti con più aree coinvolte, le lesioni non omogenee e più grandi verranno selezionate per il trattamento e la valutazione.

Protocollo di Terapia Fotodinamica:

Protocollo per la preparazione e applicazione di TB al 2,5% come PS:

Il protocollo prevede l'applicazione di TB al 2,5%, preparato seguendo procedure standard e adattando le proporzioni come indicato da Epstein et al., sulle lesioni, utilizzando punte di applicatore di cotone, con un margine di 3 mm dal tessuto normale circostante e lasciandolo agire per 5 min, evitando qualsiasi contatto con la saliva utilizzando rotoli di cotone, retrattore della guancia e apparecchio di aspirazione Protocollo per la terapia fotodinamica LED in pazienti con leucoplachia orale Attrezzatura Sorgente luminosa LED Lunghezza d'onda 630-660 nm Potenza di picco 0,04 W/cm² Fluenza 15 J/cm² Dimensione del punto 0,66 cm² Distanza Intraoralmente: Alla superficie mucosa orale (modalità a contatto) Modalità Movimento continuo, circolare, sovrapposto, in senso orario concentrico con manipolo LED perpendicolare alla superficie Durata del ciclo 360 secondi su area di 1 cm² della lesione di leucoplachia orale diagnosticata. Cicli per seduta Un ciclo per seduta Numero di sedute Quattro, Una seduta / settimana (al Giorno 0, 1 settimana, 2 settimane, 3 settimane Area di intervento Intraorale sulla lesione di leucoplachia orale (preferenza data alle lesioni non omogenee e più grandi in soggetti con coinvolgimento di più siti) Tempo di trattamento 360 sec/6 minuti per lesione di leucoplachia orale di dimensione 1 cm² /12 min per 2 cm² Dosimetria e calibrazione del dispositivo LED Ogni mese utilizzando misuratore di potenza e spettrometro

Protocollo per l'applicazione di unguento topico di Calcipotriolo (0,005%) in pazienti con leucoplachia orale:

A tutti i pazienti verrà mostrato il sito della lesione di leucoplachia orale e verrà data una dimostrazione per l'applicazione dell'unguento topico di calcipotriolo (0,005%). Ai pazienti viene consigliato di applicare l'unguento di calcipotriolo due volte al giorno per 4 settimane dopo i pasti.

Passaggi nell'applicazione dell'unguento topico di Calcipotriolo (0,005%):

Asciugare il sito della lesione con garza sterile Applicare l'agente come unguento con un bastoncino di cotone Lasciare l'unguento per almeno 30 minuti Evitare di deglutire il farmaco Evitare di bere/mangiare/sputare per almeno 30 minuti dopo l'applicazione del farmaco Reiterazione del protocollo al soggetto con dimostrazione fisica ad ogni visita di follow-up

Formazione degli operatori:

L'operatore e l'assistente, che somministrano e assistono la terapia PDT intraorale, saranno formati sul protocollo secondo lo studio.

Monitoraggio terapeutico della PDT:

Il sito di applicazione della PDT sarà valutato continuamente per qualsiasi disagio, esacerbazione o aumento delle dimensioni della lesione, ulcerazione, eritema, sensazione di bruciore, dolore (aumento dei punteggi NRS NRS≥8) o sviluppo di reazione al PS durante la terapia e durante il follow-up.

Le seguenti opzioni saranno considerate durante la terapia PDT:

Interrompere/Rinviare il trattamento. I soggetti saranno intervistati per conoscere eventuali effetti avversi che potrebbero percepire dopo l'inizio del trattamento con PDT.

Monitoraggio terapeutico dell'unguento di Calcipotriolo (0,005%):

Il sito di applicazione del calcipotriolo sarà valutato continuamente per qualsiasi disagio, esacerbazione o aumento delle dimensioni della lesione, ulcerazione, eritema, sensazione di bruciore, dolore (aumento dei punteggi NRS - differenza di NRS≥5 dalla visita precedente) o sviluppo di qualsiasi reazione al calcipotriolo (0,005%) durante l'applicazione e durante il follow-up.

Le seguenti opzioni saranno considerate durante la terapia con Calcipotriolo (0,005%):

Interrompere/Rinviare la sua applicazione. I soggetti saranno intervistati per conoscere eventuali effetti avversi che potrebbero percepire dopo l'applicazione del calcipotriolo (0,005%).

Deviazione dal Protocollo: Se i soggetti hanno esacerbazione o aumento delle dimensioni della lesione, ulcerazione, eritema, sensazione di bruciore, dolore (aumento dei punteggi NRS - differenza di NRS≥5 dalla visita precedente) o sviluppano reazione al PS/Calcipotriolo (0,005%) saranno ritirati dallo studio.

Quando/Se i soggetti sviluppano cambiamenti sospetti di malignità (erosione, ulcerazione, indurimento, crescita esofitica) durante il follow-up, subiranno una biopsia incisionale per escludere cambiamenti maligni e saranno gestiti secondo il protocollo istituzionale per le lesioni maligne orali mediante rinvio all'IRCH.

5.6 Dosaggi del farmaco Tutti i soggetti nei tre gruppi riceveranno la stessa gestione convenzionale standard non invasiva consigliata per la leucoplachia orale secondo le attuali evidenze scientifiche. La PDT topica utilizzerà il blu di toluidina al 2,5% come fotosensibilizzatore per la PDT e verrà utilizzato l'unguento di calcipotriolo (0,005%).

5.7 Durata del trattamento La PDT e la terapia topica con calcipotriolo saranno somministrate secondo il protocollo sopra menzionato. Poiché la leucoplachia orale ha il rischio di trasformazione maligna, tutti i soggetti nel gruppo di studio saranno tenuti sotto regolare follow-up secondo il protocollo standard

5.8. Indagini specificamente correlate ai progetti

Procedura dello Studio:

Un questionario strutturato sarà utilizzato per registrare la storia medica passata, la storia della malattia attuale e i sintomi, ecc., seguito da esame clinico/fisico dei soggetti per diagnosticare la leucoplachia orale secondo la classificazione di Van der wall della leucoplachia orale.

Valutazione Clinica:

• Esame extraorale: Per ulcera, ascesso, seno, fistola, cicatrici, sinusite paranasale, paralisi, tic, distonie, asimmetria facciale, ostruzione nasale
• Gonfiore facciale: sito, dimensione, colore, consistenza, contorno, dolorabilità
• Linfonodo cervicale: sito, dimensione, consistenza, contorno, dolorabilità
• Esame Intraorale:

Storia della lesione bianca Localizzazione, Inizio, Colore, Tessitura, Indurimento, Progresso, Sensazione di bruciore, Trisma, Disfagia, Scarsa igiene orale, Durata (mesi), Dolore (NRS 0-10), Sensazione di bruciore (NRS 0-10), Sanguinamento, Gonfiore, Xerostomia, Denti taglienti, Trattamenti passati per leucoplachia orale Storia delle abitudini orali: Tipo, Quantità, Frequenza/giorno, durata in mesi, suo stato attuale e periodo di cessazione.

Tutti i soggetti riceveranno una breve consulenza comportamentale per la cessazione delle abitudini secondo le linee guida nazionali e il protocollo dipartimentale Esame intraorale di altri tessuti: Tessuti mucogengivali, Denti, Parodonto, Occlusione

Raccolta di campioni per citochine salivari pro-oncogene IL6, TNF-α, PCNA, Survivin e VEGF pre e post terapia:

Quattro spugne oftalmiche sterili PVA (Merocel) saranno utilizzate per raccogliere campioni di secrezioni orali per lo studio di quattro citochine dalla mucosa buccale orale Questo è un metodo non invasivo e lo rende sito-specifico, il che è un vantaggio rispetto ad altre stime sieriche e salivari. Questa procedura verrà eseguita per pre e post terapia durante il follow-up. Ai soggetti verrà chiesto di astenersi dal mangiare, bere e sciacquare la bocca almeno 2 ore prima del campionamento. Le spugne saranno pre-inumidite con soluzione fisiologica sterile, mantenute a contatto con la lesione/mucosa buccale senza strofinare o movimento per 1 minuto e poi immediatamente conservate in contenitori sterili a -80 °C fino all'analisi successiva tramite ELISA. Un registro fotografico e clinico del sito del campione sarà conservato con la scheda del paziente per riferimento futuro.

Quantificazione dei livelli di citochine salivari pro-oncogene (IL6, TNF-α, PCNA, Survivin e VEGF) mediante ELISA (pg/ng per ml) Le spugne oftalmiche (Merocel) saranno scongelate a temperatura ambiente per 10 min. Le spugne saranno quindi inserite in una provetta microcentrifuga contenente un filtro da 0,2 μm (provetta centrifuga SpinX), equilibrate aggiungendo 300 μl di buffer di estrazione e incubate per 30 min a 4 °C, seguite da centrifugazione a 4 °C per 30 min a 14.000 giri/min. Dopo la centrifugazione, il surnatante risultante sarà raccolto per la quantificazione dei livelli (IL6, TNF-α, PCNA, Survivin e VEGF) mediante metodo ELISA con kit disponibili in commercio. Il surnatante sarà conservato a -80 °C fino all'uso.

Un anticorpo monoclonale contro gli antigeni (IL6, TNF-α, PCNA, Survivin e VEGF) è stato pre-rivestito nei pozzetti delle strisce di microtitolazione fornite. Gli antigeni presenti nel campione o standard saranno incubati con le piastre per consentire il legame degli antigeni all'anticorpo. Questo è seguito dall'aggiunta di un anticorpo monoclonale primario anti-(IL6, TNF-α, PCNA, Survivin e VEGF) rispettivamente coniugato a biotina nelle rispettive piastre di microtitolazione. Un anticorpo coniugato avidin-HRP specifico per l'anticorpo primario sarà quindi aggiunto ai pozzetti. Dopo l'incubazione e un lavaggio, per rimuovere qualsiasi reagente enzimatico anticorpale non legato, un reagente substrato TMB monofase reattivo con HRP sarà aggiunto ai pozzetti. Lo sviluppo del colore sarà interrotto aggiungendo acido e l'assorbanza sarà misurata a 450 nm. Una curva di riferimento sarà ottenuta tracciando le diverse concentrazioni dei campioni standard rispetto all'assorbanza e i livelli degli antigeni nei campioni testati saranno calcolati tramite il suo grafico standard.

Eventi Avversi Dolore orale: La scala di valutazione numerica (NRS) è uno strumento di screening del dolore, comunemente utilizzato per valutare la gravità del dolore in quel momento utilizzando una scala 0-10, con zero che significa "nessun dolore" e 10 che significa "il dolore peggiore immaginabile". Al paziente viene chiesto di cerchiare il numero tra 0 e 10 che si adatta meglio all'intensità del dolore. In molti contesti clinici, il dolore viene valutato regolarmente nelle cure ambulatoriali utilizzando la NRS; questi punteggi sono registrati nella cartella sanitaria elettronica (EHR) del paziente, consentendo a ricercatori e clinici di monitorare l'intensità del dolore nel tempo (70). Un punteggio NRS iniziale sarà preso all'arruolamento nello studio. Punteggi NRS successivi, così come la percezione del paziente del cambiamento del proprio dolore dall'ultima misurazione (cioè "molto meno", "poco meno", "circa lo stesso", "poco più" o "molto più") saranno registrati al basale e ad ogni visita del protocollo PDT/Calcipotriolo e successivo follow-up al giorno 7, giorno 14, giorno 21, giorno 28 e giorno 120 post trattamento. Ogni punteggio NRS sarà fatto su una nuova scala non marcata. Ai pazienti non sarà permesso di rivedere i loro punteggi precedenti.

Sensazione di bruciore orale: La stessa procedura con scala NRS sarà seguita per la valutazione della sensazione di bruciore orale Reazione Allergica: A tutti i soggetti verrà chiesto di segnalare immediatamente qualsiasi reazione allergica locale/sistemica derivante dagli interventi come arrossamento e gonfiore dovuti al fotosensibilizzatore blu di toluidina, reazioni mucose o cutanee dovute al calcipotriolo all'investigatore in qualsiasi momento durante lo studio. Gli interventi saranno sospesi e gli interventi correttivi saranno avviati immediatamente e l'evento avverso sarà registrato e segnalato secondo il protocollo istituzionale.

Cambiamento maligno: Qualsiasi cambiamento nella lesione al sito di trattamento o altre aree della cavità orale in qualsiasi momento della sperimentazione, che sia sospetto/evidente per cambiamento maligno (ulcerazione, indurimento) subirà biopsia e sarà ritirato dallo studio dopo conferma Recidiva: Qualsiasi ricomparsa della lesione al sito di trattamento e valutazione vii. Diario del paziente: Registrazione di Dolore, sensazione di bruciore, stato delle abitudini, dimensione della lesione (aumento/diminuzione/scomparsa/recidiva) allergia, arrossamento, gonfiore e farmaci dimenticati) A tutti i soggetti verrà chiesto di registrare la frequenza, durata e fattori esacerbanti del dolore e della sensazione di bruciore. Lo stato dell'abitudine, il suo uso attuale, la frequenza di consumo, il periodo di cessazione saranno anche registrati nella scheda fornita ai pazienti. Il paziente sarà guidato a fare auto-esame della lesione e qualsiasi aumento o diminuzione delle dimensioni sarà annotato nella scheda fornita nel diario. I punteggi basali saranno registrati pre-randomizzazione per prevenire bias nella valutazione da parte dell'investigatore. I punteggi saranno registrati ad ogni sessione, post trattamento a 1 settimana, 2 settimane, 3 settimane 4 settimane e 12 settimane dallo stesso investigatore per entrambi i gruppi.

viii. Criteri di Ritiro: Se qualsiasi paziente ritira il consenso dopo l'inizio del trattamento/ c'è una reazione allergica/ cambiamento maligno/ esacerbazione del dolore e sensazione di bruciore che non è controllata da anestetici, analgesici, antisettici, (NRS ≥ 8) allora il soggetto sarà ritirato dallo studio.

Analisi Statistica:

I dati saranno inseriti in un foglio Excel secondo la scheda preparata Le caratteristiche basali saranno confrontate tra i gruppi utilizzando il test chi-quadro (variabili categoriali) e il test t non appaiato/test di Wilcoxon-ranked (variabili continue). Sia l'analisi intention-to-treat che per-protocollo saranno eseguite per l'esito primario. L'esito primario, tasso di risposta completa, sarà confrontato tra i gruppi utilizzando il test z per due proporzioni. Il test esatto di Fisher sarà utilizzato per l'analisi degli eventi avversi. La risposta completa e il tempo alla recidiva saranno confrontati tra i gruppi utilizzando la curva di Kaplan-Meier seguita dal test log-rank. I risultati saranno presentati come Differenza in medie/proporzioni con intervallo di confidenza al 95% e p<0,05% sarà considerato statisticamente significativo.