微生物叢と STEMI の分析

高血糖は、急性冠症候群 (ACS) と診断された患者によくみられる所見であり、糖尿病の有無にかかわらず患者の死亡率の独立した予測因子です (1-4)。 経皮的冠動脈インターベンション (PCI) は ST 上昇型心筋梗塞 (STEMI) (4-6) の基礎ですが、高血糖患者の心不全、再梗塞および死亡の発生率は依然として高く、死亡率は 40 を超えています。 % イベントの 1 年後 (4-5)。 実際、再狭窄およびノー​​リフロー現象は、一次 PCI を受ける高血糖患者の臨床転帰を悪化させる一般的な事象であり、アテローム血栓塞栓症、酸化ストレスおよび炎症の増加をもたらします (3-6)。 高血糖による死亡率の増加に対抗する試みとして、冠動脈ユニットは ACS 中の血糖値を正常化するためのインスリンプロトコルを実装しましたが、同じインスリン治療が相反する結果を示しました (7)。 小規模なパイロット研究、中等度の臨床試験、およびメタ分析からのデータは、インスリン療法の利点を示唆しています (1-3.5)。 一方、その後の無作為化臨床試験では、生存率の増加は確認されていません (7, 8) 。 さらに、二重抗凝集療法が現在 PCI によって治療される STEMI 患者の治療の基礎である場合 (9)、ますます頻繁な抗凝集療法と出血現象が治療効果を低下させる可能性があります (11 -13)。 したがって、二重抗凝集療法および高血糖ストレスに対する個々の反応は、耐性メカニズムに影響を与え、および/または微生物フローラによる薬理学的機能の不活性化の増加につながる可能性があります。 微生物叢という用語は、生態学的ニッチに存在し、「ヒト微生物叢」を構成する微生物のゲノム全体を示します (14)。 分析された解剖学的地区によると、腸、眼、頬、膣の微生物叢などについて話します。 MetaHIT コンソーシアムによるメタゲノム手法で実現された、ヒトの腸管に生息する微生物の DNA 解析により、300 万を超える遺伝子が特定されました。これは、ヒト種の 150 倍です (16-21)。 さらに、高血圧や冠動脈疾患などの心血管疾患は、腸内の腸内細菌科、ファーミキューテス属、およびラットバチルス属の存在によって強く条件付けられており、これらが発症を決定する可能性があります (22)。 これに関連して、PCI前、退院時、およびフォローアップ時の糞便微生物叢の分析は、代謝酸化プロセスの変化を伴う高血糖患者を特定するのに有用であると考えられ、血栓形成促進性は処置後の予後不良と相関します( 23 ）。 糞便微生物叢のサンプルを簡単に入手できること、および関連する科学界や日常の臨床診療への影響により、微生物叢のゲノム、代謝、および細胞分析とともに臨床研究を主張し、できるだけ多くを抽出することが求められています。 STEMIの高血糖患者で可能な限り情報。 この調査は、STEMI の入院中の高血糖患者の科学的研究および臨床診療で提案されたことはありません。 実際、多くの証拠は、高血糖がアテローム硬化性プラークと血栓の両方で酸化ストレスと炎症の増加を引き起こし、したがってSTEMIのより悪い結果を決定する上で中心的な役割を果たしていることを示唆しています. したがって、イベント中の糞便微生物叢の分析は、理論的には、高血糖によって引き起こされる過度の炎症性および酸化性緊張、二重抗凝集療法および冠動脈ステント留置術に対するコンディショニング耐性、および PCI による冠動脈再灌流後のプロトロンビン現象のコンディショニングを伴う高血糖患者を特定することができます。 したがって、著者は、急性高血糖および正常血糖冠動脈症候群の患者の微生物叢を分析する研究を実施します。

目的 この研究の主な目的は、微生物叢の変化と、PCI前、および高血糖性STEMI患者の6か月および12か月後に採取された糞便物質に対するその活動を評価し、微生物叢の変化が関連する可能性があるかどうかを評価することです。 12か月の予後まで。

材料と方法 患者 これは、高血糖 STEMI 患者と正常血糖患者から採取した糞便サンプルにおける微生物叢の変化とその活動の影響を調査するためのコホート研究です。 これらの患者は、"Luigi Vanvitelli" University of Campania の循環器科で採用されている日常的な "実生活" の治療法に従って治療されます。 退院後、すべての患者は、STEMI 後の患者の管理に関するガイドライン (6) で示されているように、カンパニア大学「Luigi Vanvitelli」の心臓病学科で、対照診察を受けるよう招待されます。 "Luigi Vanvitelli" カンパニア大学の内科 VI 部門。 すべての患者は、経過観察として、イベント後 12 か月間監視されます。 アメリカ心臓協会の最近の定義によると、高血糖は空腹時血糖値が 140 mg/dl を超えることによって定義されます (1, 9)。 12 時間以内に症状が発現し、2 つ以上の隣接する末梢誘導で ST セグメントが 1 mm 上昇するか、2 つ以上の隣接する前胸部誘導で少なくとも 2 mm 上昇するか、または新たに発症した左枝ブロックを有するすべての患者は、PCI の対象となります。 包含基準には以下が含まれます: 18 歳以上で、STEMI の最初のエピソードへの入場。 -左室駆出率が25％未満で、以前のIMAまたは以前のPCIおよび/またはバイパスを有する患者は除外されます。 インフォームドコンセントに署名した後、それぞれが研究に含まれます。 ルーチンの血液学的分析は、受け入れ時、医学療法の実施前、冠動脈検査の可能性がある前、および6か月後と12か月後に実行されます。 これらの時点で採取された血液サンプルのアリコートで、トリメチルアミン-N-オキシド (TMAO) を評価します。トリメチルアミン-N-オキシド (TMAO) は細菌の代謝産物であり、その血清レベルの上昇は有害な心血管イベントと関連しています (24)。 さらに、PCI の前、および 6 か月後と 12 か月後に、便のサンプルが採取され、その後微生物叢が分析されます。 研究は、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施されます。

手順 この研究では、著者は、カンパニアの「Luigi Vanvitelli」大学の循環器科に入院し、二重抗凝集療法で治療された STEMI 患者のコホートを評価します。 すべての患者は、STEMIに関する最新のガイドラインの提案されたプロトコルに従って治療されます（6）。 患者は 2 つのグループに分類されます。 微生物叢は、糞便から抽出され、準備された後に分析されます。 膨大な量の微生物が存在するのに比べて、大多数の腸内細菌を実験室で培養することは臨床現場では不可能です。 糞便物質から抽出された細菌 DNA を配列決定する最新の技術 (次世代シーケンシング) のおかげで、腸内微生物叢の完全で信頼性の高い同定が可能になりました。 存在する細菌種を特定することに加えて、著者は、微生物叢 (または dysbiosis) の全体的な健康度、いくつかの有用または有害な物質の生産におけるその効率、いくつかの基本的な機能に関する微生物叢の妥当性を表現することもできます。これには、炎症性腸疾患、代謝性疾患、および老化に対する微生物叢自体の傾向とその傾向があります。 その結果、微生物叢パスポートと名付けられた、驚くべき量のデータ、微生物叢の真の身分証明書ができあがります。

サンプルの準備と分析。 微生物叢を配列決定するためのサンプルは、糞便から収集され、元のサンプルへの損傷を避けるために超低温 (-80°C) で保存されます。 微生物叢の配列決定は、カンパニア大学の微生物学研究室「Luigi Vanvitelli」によって行われます。 微生物叢のシーケンシングには、「次世代シーケンシング」(NGS) メソッドを使用します。これにより、イルミナの機械 (カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、数百万の DNA フラグメント (25) を並行してシーケンシングできます。 DNAは、再現性の高い市販のキット手順（Qiagen、Invitrogen）を使用して、これらのサンプルから抽出されます。 抽出された DNA の最終収量と品質は、NanoDrop ND-1000 分光光度計 (ThermoScientific、Waltham、MA) および QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co.、Carlsbad、CA) を使用して決定されます。 抽出された DNA は、プライマーを使用した PCR によって増幅されます: フォワード: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 'およびリバース: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013)、16S の超可変領域 V3 および V4 をターゲットにします。 rRNA遺伝子。 各 PCR 増幅は、メタゲノム配列決定用の 16S ライブラリーの調製のためのプロトコル (Illumina、San Diego、CA) によって実行されます。 増幅産物は、Ｑｕｂｉｔ ｆｌｕｏｒｉｄａｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量化され、２ｎＭの最終濃度で各サンプルの等モル量でグループ化される。 Phix コントロール ライブラリ (イルミナ) がサンプルに追加されます。 グループ化されたサンプルは、MiSeq プラットフォーム (イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ) でシーケンスされます。 このようにして得られたデータは、FastQC によるバイオインフォマティクス分析による品質管理に供されます。 最後に、データは、メタゲノム配列決定のガイドラインで提案されている統計テストに従って分析されます。 患者データは相互に比較され、時間の経過とともに参照データベースと比較されます。 微生物叢のエピジェネティックな活性と、サイトカインとフリーラジカルの生化学的投与量の評価は、カンパニア大学の薬理学研究所「Luigi Vanvitelli. 特に、STEMI を有する各個々の高血糖患者と正常血糖患者の微生物叢のエピジェネティックな活性を評価するために、プロトコル QIAGEN (イタリア) に従って、糞便からの総 RNA の抽出を進めます。 - 1 分子 (microRNA) の重み付け。 抽出された RNA の最終的な収量と品質は、NanoDrop ND-1000 分光光度計 (ThermoScientific、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して決定されます。 qRT-PCR (QIAGEN、イタリア) により、次の糞便マイクロ Rna の発現レベルが検出されます: miR-10b、miR-204、miR-29、miR-496、miR-1224-5p、miR-470、および miR-663腸内微生物叢の調節に関与しています。 miR-10a および miR-18b は、腸内微生物叢および代謝性炎症の調節に関与しています。 miR-106a、miR-17、miR-19a、miR-20a、miR-206、miR-222、および miR-223 は、代謝性炎症およびシグナル伝達インスリン/IGF-1 に関与します (26)。 高血糖患者と正常血糖患者のそれぞれの STEMI 患者における微生物叢の代謝活性は、糞便サンプルからの短鎖脂肪酸 (SCFA) の測定によって評価されます。細菌発酵の産物である糞便 SCFA のレベルは、 2型糖尿病の改善(27)。 微生物叢の炎症活性は、LPS (28-29)、IL-1β、および IL-6 (30-32) の糞便レベルを測定することによって評価され、酸化活性は、ROS、SOD、およびGSH（33-34）。

フォローアップの著者らの研究は、RCT の一般化可能性を制限する厳格な規則からの干渉なしに、STEMI の高血糖患者と正常血糖患者を「実生活」で管理するように設計されています。 したがって、退院後、すべての患者は、カンパニア大学「Luigi Vanvitelli」の心臓病部門で、STEMI後の患者の管理に関するガイドライン（6）で示されているように、対照訪問を実施するよう招待されます。 、および "Luigi Vanvitelli" カンパニア大学の内科 VI 部門で。 すべての患者は、STEMI患者の管理に関するガイドラインで示されているように、追跡調査としてイベント後12か月間監視されます（ECG、運動負荷試験、心エコー図、グルコースレベル）。 これらの時点で、微生物叢の分析のために糞便サンプルも採取されます。 さらに、12か月のフォローアップにおける血糖代償の管理と評価には、HbA1cレベルを7%未満、血糖値を90～140mg/dl、食後血糖値を180mg未満に維持するために、医師も関与します。 / dl。

心血管エンドポイント 両方のコホートの心血管エンドポイントには、心筋再梗塞、冠動脈疾患（再狭窄、ステント留置または大動脈冠動脈バイパス）による再入院、心不全、脳卒中、心臓死亡率、およびすべての死亡原因が含まれます。 . 主要な複合エンドポイントは、心筋梗塞、心不全による入院、脳卒中、または心臓死などの心血管イベントで構成されます。 二次エンドポイントは、心機能の評価で構成されます。駆出率の減少、左心室の容積の増加、冠動脈灌流の減少です。 すべての死亡は再調査され、心疾患（IMA、心室性不整脈、難治性心不全による死亡）または非心疾患に分類されます。 すべての血行再建術は、早期（冠動脈造影後 60 日以内の選択的血行再建術）または後期に分類されます。 後期血行再建術のみが心臓イベントとして分類されるため、早期の選択的血行再建術を受けた患者は分析から除外されます。

統計分析 2 つのグループは、カテゴリ変数にはピアソン χ2 検定を使用し、連続変数にはクラスカル-ワリス検定を使用して比較します。 多変数モデルへのエントリの共変量候補は、高血糖患者と正常血糖患者の間の単変量解析で有意に異なる要因 (P 値 < 0.05) に集中することによって識別されます。 Cox 回帰を使用して死亡率モデルを構築します。 死亡率のハザード比は、年齢、BMI、コレステロール、LDL、トリグリセリドおよびアスピリン療法、チクロピジン、抗凝集薬の組み合わせ、β遮断薬、ACE 阻害薬またはサルタン、抗糖尿病薬、スタチン、STEMI による入院中に調整されます。 カプラン・マイヤー曲線とコックス回帰法を使用して、STEMI から 1 年目までの生存分析を行います。 ログランク検定を使用して比較するために、正常血糖に対する高血糖患者の死亡率曲線を別々に取得します。 p 値 <0.05 の場合、すべてのテストは有意と見なされます。 すべての分析は、2 つの研究集団で実行されます。 高血糖患者と正常血糖患者の転帰を比較する「非倹約的」ロジスティック回帰モデルを使用して、「傾向スコア」分析を実施する。 モデルには、年齢、性別、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、多血管疾患、慢性腎不全、TIMI 手術前の流れ、駆出率、手術の成功など、より多くの変数が含まれます。 C スコアは良好な識別を示します。 「一致した」サンプルに基づいて、Cox 比例リスク モデルを使用して、フォローアップ中の死亡率に対する高血糖および微生物フローラ活動の影響を判断します。 SPSS (バージョン 21、IBM SPSS) がすべての分析に使用されます。

サンプル サイズ サンプル サイズは、GPOWER ソフトウェアによって IBM PC コンピュータで計算されます。 サイズ効果は、高血糖患者に対して実施された疫学的研究および介入研究に従って計算されます。 タイプ I エラーが 0.05 で検出力が 95% の 25% のグローバル効果で推定されるサンプル サイズは 200 人の参加者で、正常血糖患者で構成されるグループの場合は 100、高血糖患者のグループの場合は 100 です。