微生物群和 STEMI 分析

高血糖是诊断为急性冠脉综合征 (ACS) 患者的常见表现，并且是糖尿病患者和非糖尿病患者死亡率的独立预测因子 (1-4)。 尽管经皮冠状动脉介入治疗 (PCI) 是治疗 ST 段抬高型心肌梗死 (STEMI) 的基石 (4-6)，但高血糖患者心力衰竭、再梗死和死亡的发生率仍然很高，死亡率超过 40 % 事件发生一年后 (4-5)。 事实上，在接受直接 PCI 的高血糖患者中，再狭窄和无复流现象是导致更差临床结果的常见事件，并导致动脉粥样硬化血栓栓塞、氧化应激和炎症增加 (3-6)。 为了应对高血糖导致的死亡率增加，冠状动脉病房在 ACS 期间实施了胰岛素方案以使血糖正常化，但相同的胰岛素治疗显示出相互矛盾的结果 (7)。 来自小型试点研究、适度临床试验和荟萃分析的数据表明胰岛素治疗有益 (1-3.5)。 另一方面，随后的随机临床试验并未证实存活率增加 (7, 8) 。 此外，如果双重抗聚集治疗是目前PCI治疗STEMI患者的治疗基础(9)，越来越频繁的抗聚集治疗和出血现象，可能会降低其治疗效果(11 -13)。 因此，个体对双重抗聚集疗法和高血糖应激的反应可能会影响耐药机制，和/或导致微生物菌群的药理功能失活增加。 微生物群一词表示存在于生态位中的微生物基因组的总和，它们构成了“人类微生物群”(14)。 根据分析的解剖学区域，我们谈到肠道、眼部、口腔、阴道微生物群等。 生活在人类肠道中的微生物的 DNA 分析，由 MetaHIT 联盟通过宏基因组方法实现，已经确定了超过 300 万个基因，是人类物种的 150 倍 (16-21)。 此外，高血压和冠状动脉疾病等心血管疾病在肠道中存在肠杆菌科、厚壁菌门和乳杆菌的强烈条件下，这可以决定它们的发作 (22)。 在这种情况下，PCI 前、出院时和随访时粪便微生物群的分析可被认为有助于识别代谢氧化过程改变的高血糖患者，并且促血栓形成与较差的术后预后相关（23 ). 获取粪便微生物群样本的便利性，以及对科学界和常规临床实践的相关影响，促使我们坚持临床研究，连同微生物群的基因组、代谢和细胞分析，并尽可能多地提取STEMI 高血糖患者的尽可能多的信息。 这项调查从未在STEMI住院高血糖患者的科学研究和临床实践中提出。 事实上，大量证据表明，高血糖会导致动脉粥样硬化斑块和血栓中氧化应激和炎症的产生增加，因此它在决定 STEMI 患者预后不良方面起着核心作用。 因此，事件期间粪便微生物群的分析可以从理论上识别高血糖患者因高血糖引起的过度炎症和氧化张力，对双重抗聚集治疗和冠状动脉支架置入术的调节抵抗，以及PCI冠状动脉再灌注后的调节促血栓现象。 因此，作者将进行一项研究来分析急性高血糖和正常血糖冠状动脉综合征患者的微生物群。

目的 本研究的主要目的是评估高血糖 STEMI 患者在 PCI 前、6 个月和 12 个月后采集的粪便中微生物群的任何变化及其活性，并评估微生物群的变化是否与粪便有关到 12 个月的预后。

材料和方法 患者 这是一项队列研究，旨在调查微生物群的可能变化及其活性对高血糖 STEMI 患者与血糖正常患者的粪便样本的影响。 这些患者根据坎帕尼亚“Luigi Vanvitelli”大学心脏病科采用的常规“现实生活”治疗实践进行治疗。 出院后，将邀请所有患者进行对照访视，如 STEMI 后患者管理指南 (6) 所示，在坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”心脏病科和坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”内科第六科。 事件发生后，将对所有患者进行为期 12 个月的监测，作为随访。 根据美国心脏协会最近的定义，高血糖症将定义为空腹血糖水平 > 140 mg/dl (1, 9)。 所有在 12 小时内出现症状且 2 个或更多相邻外周导联 ST 段抬高 1 毫米或 2 个或更多相邻心前导联至少 2 毫米或新发左支传导阻滞的患者将考虑接受 PCI。 纳入标准将包括：年龄超过 18 岁且因 STEMI 首发入院。 左心室射血分数 <25%、既往有 IMA 或既往 PCI 和/或搭桥术的患者将被排除在外。 在签署知情同意书后，每个人都将被纳入研究。 常规血液学分析将在接受时、进行药物治疗和可能的冠状动脉检查之前以及 6 个月和 12 个月后进行。 在这些时间采集的等份血样中，我们将评估三甲胺-N-氧化物 (TMAO)，这是一种细菌代谢产物，其升高的血清水平与不良心血管事件有关 (24)。 此外，在 PCI 之前以及 6 个月和 12 个月后，将采集粪便样本，随后将对粪便样本进行微生物群分析。 研究将按照赫尔辛基宣言的原则进行。

程序 在这项研究中，作者将评估一组入住坎帕尼亚“Luigi Vanvitelli”大学心脏病科并接受双重抗聚集治疗的 STEMI 患者。 所有患者都将根据最新的 STEMI 指南 (6) 的建议方案进行治疗。 患者将被分为两组：高血糖患者与血糖正常患者，将对两组患者进行粪便微生物群分析、PCI 前和双重抗血小板治疗前。 将从粪便材料中提取微生物群，然后进行制备和分析。 与存在的大量微生物相比，在临床实践中不可能在实验室中培养绝大多数肠道细菌。 由于对从粪便材料中提取的细菌 DNA 进行测序的最新技术（下一代测序），现在可以对肠道微生物群进行完整可靠的鉴定。 除了识别存在的细菌种类外，作者还能够表达微生物群的整体健康程度（或生态失调）、它在生产一些有用或有害物质方面的效率、微生物群在某些基本功能方面的充分性与之相反的是微生物群本身对抗炎症性肠病、代谢性疾病和衰老的倾向。 结果是大量的数据，微生物群的真实身份证，称为微生物群护照。

样品制备和分析。 将从粪便材料中收集用于微生物群测序的样本，并在超低温（-80°C）下储存，以避免损坏原始样本。 微生物群的测序将由坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”微生物学实验室进行。 对于微生物群的测序，我们将使用“下一代测序”(NGS) 方法，该方法允许通过使用 Illumina 机器（加利福尼亚州圣地亚哥）对数百万个 DNA 片段 (25) 进行并行测序。 使用高再现性商业试剂盒程序（Qiagen，Invitrogen）从这些样品中提取 DNA。 提取的 DNA 的最终产量和质量将使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计（ThermoScientific，Waltham，MA）和 QubitFluorometer 1.0（Invitrogen Co.，Carlsbad，CA）来确定。 提取的 DNA 将使用以下引物通过 PCR 扩增：正向：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' 和反向：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013)，其靶向 16S 的高变区 V3 和 V4 rRNA基因。 每个 PCR 扩增将按照为宏基因组测序准备 16S 文库的方案进行（Illumina，San Diego，CA）。 扩增产物将通过 Qubit 氟化仪（Invitrogen Co., Carlsbad, CA）定量，并以每个样品的等摩尔量分组，最终浓度为 2nM。 Phix 控制库 (Illumina) 将添加到示例中。 然后，分组的样本将在 MiSeq 平台（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州）上进行测序。 由此获得的数据将通过使用 FastQC 的生物信息学分析进行质量控制。 最后，将根据宏基因组测序指南建议的统计检验对数据进行分析。 患者数据将相互比较，并随着时间的推移与参考数据库进行比较。 微生物群的表观遗传活性以及细胞因子和自由基的生化剂量的评估将在坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”的药理学实验室进行。 特别是，为了评估每个患有 STEMI 的高血糖与正常血糖患者的微生物群的表观遗传活性，我们将根据 QIAGEN（意大利）方案从粪便中提取总 RNA，包括低-重量一分子（microRNA）。 提取的 RNA 的最终产量和质量将使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计（ThermoScientific，Waltham，MA）确定。 通过 qRT-PCR（QIAGEN，意大利），将检测以下粪便微 RNA 的表达水平：miR-10b、miR-204、miR-29、miR-496、miR-1224-5p、miR-470 和 miR-663参与调节肠道菌群； miR-10a 和 miR-18b 参与调节肠道菌群和代谢性炎症； miR-106a、miR-17、miR-19a、miR-20a、miR-206、miR-222 和 miR-223 参与代谢炎症和信号转导胰岛素/IGF-1 (26)。 将通过测定粪便样本中的短链脂肪酸 (SCFA) 来评估每个患有 STEMI 的高血糖与血糖正常患者的微生物群的代谢活动：粪便 SCFA 的水平是细菌发酵的产物，似乎与2 型糖尿病的改善 (27)。 微生物群的炎症活性将通过确定 LPS (28-29)、IL-1β 和 IL-6 (30-32) 的粪便水平来评估，而通过分析粪便中 ROS、SOD 和谷胱甘肽 (33-34)。

后续作者的研究旨在在“现实生活”中管理高血糖与血糖正常的 STEMI 患者，而不受限制 RCT 普遍性的严格规则的干扰。 因此，出院后，将邀请所有患者在坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”心脏病科进行对照访视，如 STEMI 后患者管理指南 (6) 所示，以及坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”内科第六科。 根据 STEMI 患者管理指南 (6)，将在事件发生后对所有患者进行 12 个月的监测，作为随访，以进行临床评估（心电图、运动试验、超声心动图、葡萄糖水平）。 在这些时间点，还将采集粪便样本进行微生物群分析。 此外，在后续12个月的血糖代偿管理和评估中，医生也会参与以维持HbA1c水平<7%，血糖在90和140 mg / dl之间，餐后血糖<180 mg / dl。

心血管终点 两个队列的心血管终点将包括心肌再梗死、冠状动脉疾病再住院（再狭窄、支架植入或主动脉冠状动脉搭桥术）、心力衰竭、中风、心脏死亡率和所有死亡原因. 主要复合终点将包括心血管事件，例如心肌梗死、因心力衰竭住院、中风或心脏死亡。 次要终点将包括心脏功能的评估：射血分数降低、左心室容积增加、冠状动脉灌注减少。 所有死亡将被审查并分类为心脏病（由 IMA、室性心律失常、难治性心力衰竭引起的死亡）或非心脏病。 所有血运重建将被分类为早期（冠状动脉造影后 60 天内的选择性血运重建）或晚期。 只有晚期血运重建将被归类为心脏事件，因此早期择期血运重建的患者将被排除在分析之外。

统计分析 两组将使用分类变量的 Pearson χ2 检验和连续变量的 Kruskal-Wallis 检验进行比较。 进入多变量模型的候选协变量将通过关注那些在高血糖患者与正常血糖患者之间的单变量分析中将显着不同（P 值 <0.05）的因素来确定。 Cox 回归将用于建立死亡率模型。 在 STEMI 住院期间，死亡率的风险比将根据年龄、BMI、胆固醇、LDL、甘油三酯和阿司匹林治疗、噻氯匹定、抗聚集剂、β-受体阻滞剂、ACE 抑制剂或沙坦类药物、抗糖尿病药、他汀类药物的组合进行调整。 STEMI 第一年的生存分析将使用 Kaplan-Meier 曲线和 Cox 回归方法进行。 将分别获得高血糖患者与正常血糖患者的死亡率曲线，使用对数秩检验进行比较。 如果 p 值 <0.05，则所有测试都将被视为显着。 所有分析都将在两个研究人群中进行。 将使用“非简约”逻辑回归模型进行“倾向评分”分析，该模型将比较高血糖患者与血糖正常患者的结果。 模型中将包含更多变量，包括年龄、性别、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、多血管疾病、慢性肾功能衰竭、TIMI 术前流量、射血分数和手术成功率。 C 分数将表明良好的歧视。 基于“匹配”样本，Cox 比例风险模型将用于确定高血糖和微生物菌群活性对随访期间死亡率的影响。 SPSS（21 版，IBM SPSS）将用于所有分析。

Sample Size Sample Size 将使用IBM PC 计算机通过GPOWER 软件计算得出。 将根据对高血糖患者进行的流行病学和干预研究来计算规模效应。 根据 25% 的全局效应和 0.05 的 I 类错误和 95% 的功效估计的样本量将是 200 名参与者，100 名用于由正常血糖患者组成的组，100 名用于高血糖患者组。