Analyse van de Microbiota en STEMI

Hyperglykemie is een veel voorkomende bevinding bij patiënten met de diagnose acuut coronair syndroom (ACS) en is een onafhankelijke voorspeller van mortaliteit bij patiënten met en zonder diabetes (1-4). Hoewel percutane coronaire interventie (PCI) de hoeksteen is van myocardinfarct met ST-segmentelevatie (STEMI) (4-6), blijft de incidentie van hartfalen, herinfarct en overlijden bij hyperglykemische patiënten aanzienlijk, met een mortaliteit van meer dan 40 % een jaar na het evenement (4-5). In feite zijn restenose en no-reflow-verschijnselen vaak voorkomende gebeurtenissen die leiden tot slechtere klinische resultaten bij hyperglycemische patiënten die een primaire PCI ondergaan, en resulterend in atherotrombotische embolisatie, verhoogde oxidatieve stress en ontsteking (3-6). In een poging om de toenemende mortaliteit door hyperglykemie tegen te gaan, implementeerden de coronaire eenheden insulineprotocollen om de bloedglucose tijdens ACS te normaliseren, en dezelfde insulinebehandeling liet tegenstrijdige resultaten zien (7). Gegevens uit kleine pilotstudies, uit gematigde klinische studies en een meta-analyse suggereerden voordelen van insulinetherapie (1-3.5). Aan de andere kant hebben daaropvolgende gerandomiseerde klinische onderzoeken geen toename in overleving bevestigd (7, 8). Bovendien, als de dubbele anti-aggregatietherapie momenteel de therapeutische basis is van patiënten met STEMI die worden behandeld met PCI (9), kunnen de steeds vaker voorkomende anti-aggregatietherapie en bloedingsverschijnselen hun therapeutische werkzaamheid verminderen (11-13). Daarom is het waarschijnlijk dat de individuele reactie op de dubbele anti-aggregatietherapie en de hyperglycemische stress de resistentiemechanismen kunnen beïnvloeden en/of kunnen leiden tot een toename van farmacologische functionele deactivering door de microbiotische flora. De term microbiota geeft de totaliteit aan van de genomen van micro-organismen die zich in een ecologische niche bevinden en die de "menselijke microbiota" vormen (14). Volgens het geanalyseerde anatomische district spreken we van intestinale, oculaire, buccale, vaginale microbiota, enz. De DNA-analyse van micro-organismen die in het menselijke darmkanaal leven, gerealiseerd met metagenomische methoden door het MetaHIT-consortium, heeft meer dan 3 miljoen genen geïdentificeerd, 150 keer die van de menselijke soort (16-21). Bovendien worden hart- en vaatziekten zoals hypertensie en coronaire hartziekte sterk bepaald door de aanwezigheid van Enterobacteriaceae, Firmicutes en Lattobacilli in de darm, die hun ontstaan ​​kunnen bepalen (22). In deze context kan de analyse van de fecale microbiota vóór PCI, bij ontslag uit het ziekenhuis en bij follow-up als nuttig worden beschouwd voor het identificeren van hyperglykemische patiënten met verandering van metabole-oxidatieve processen, en protrombotische correlaties met een slechtere postprocedurele prognose (23 ). Het gemak van het verkrijgen van monsters van de fecale microbiota, en de relevante impact op de wetenschappelijke gemeenschap en op de routinematige klinische praktijk, dwingen ons om aan te dringen op klinisch onderzoek, samen met een genomische, metabole en cellulaire analyse van de microbiota, en om zoveel mogelijk te extraheren informatie mogelijk bij hyperglykemische patiënten met STEMI. Dit onderzoek is nooit voorgesteld in het wetenschappelijk onderzoek en de klinische praktijk van gehospitaliseerde hyperglykemische patiënten voor STEMI. Inderdaad, een grote hoeveelheid bewijs suggereert dat hyperglykemie een toenemende productie van oxidatieve stress en ontsteking veroorzaakt, zowel in atherosclerotische plaque als in de trombus, en daarom speelt het een centrale rol bij het bepalen van slechtere resultaten bij STEMI. Daarom zou de analyse van de fecale microbiota tijdens het evenement theoretisch hyperglycemische patiënten kunnen identificeren met overmatige inflammatoire en oxidatieve tonus veroorzaakt door hyperglycemie, conditionerende weerstand tegen dubbele anti-aggregatietherapie en coronaire stenting, en conditionerende protrombotische verschijnselen na coronaire reperfusie door PCI. Daarom zullen de auteurs een studie uitvoeren om de microbiota te analyseren bij patiënten met acuut hyperglykemisch en normoglycemisch coronair syndroom.

DOELSTELLINGEN Het primaire doel van deze studie is het evalueren van eventuele veranderingen in de microbiota en de activiteit ervan op fecaal materiaal dat is ingenomen vóór PCI, en na 6 en 12 maanden bij patiënten met hyperglycemische STEMI, en ook om te evalueren of de veranderingen in de microbiota verband kunnen houden naar de 12-maandenprognose.

MATERIALEN EN METHODEN Patiënten Dit is een cohortstudie om de effecten te onderzoeken van mogelijke veranderingen in de microbiota en de activiteit ervan in fecale monsters genomen van patiënten met hyperglykemische STEMI v/s normoglycemische. Deze patiënten worden behandeld volgens routinematige "real life" therapeutische praktijken, aangenomen op de afdeling Cardiologie van de "Luigi Vanvitelli" Universiteit van Campania. Na ontslag uit het ziekenhuis zullen alle patiënten worden uitgenodigd om controlebezoeken af ​​te leggen, zoals aangegeven in de richtlijnen voor de behandeling van post-STEMI-patiënten (6), bij de afdeling Cardiologie van de Universiteit van Campania "Luigi Vanvitelli" en bij de VI Afdeling Interne Geneeskunde van de "Luigi Vanvitelli" Universiteit van Campanië. Alle patiënten zullen gedurende 12 maanden na het evenement worden gecontroleerd als follow-up. Volgens de recente definitie van de American Heart Association wordt hyperglycemie gedefinieerd door nuchtere bloedglycemische niveaus> 140 mg / dl (1, 9). Alle patiënten met aanvang van de symptomen binnen 12 uur en 1 mm elevatie van het ST-segment in 2 of meer aaneengesloten perifere afleidingen of ten minste 2 mm in 2 of meer aaneengesloten precordiale afleidingen of een nieuw ontstaan ​​linkertakblok komen in aanmerking voor PCI. Inclusiecriteria zijn onder meer: ​​leeftijd ouder dan 18 en toelating voor de eerste aflevering van STEMI. Patiënten met een linkerventrikelejectiefractie <25%, met eerdere IMA of eerdere PCI en/of bypass worden uitgesloten. Elk zal worden opgenomen in de studie na ondertekening van een geïnformeerde toestemming. Routinematige hematologische analyse zal worden uitgevoerd op het moment van acceptatie, vóór medische therapie en mogelijk onderzoek van de kransslagader en na 6 en 12 maanden. Op een deel van het bloedmonster dat op deze momenten wordt genomen, zullen we trimethylamine-N-oxide (TMAO) evalueren, een product van bacterieel metabolisme, waarvan verhoogde serumspiegels geassocieerd zijn met ongunstige cardiovasculaire gebeurtenissen (24). Daarnaast wordt voor de PCI, en 6 en 12 maanden later, een ontlastingsmonster genomen waarop vervolgens de microbiota wordt geanalyseerd. Het onderzoek zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Helsinki-verklaring.

Procedure In deze studie zullen de auteurs een cohort van patiënten met STEMI evalueren die zijn opgenomen in de afdeling Cardiologie van de "Luigi Vanvitelli" Universiteit van Campanië, en worden behandeld met dubbele antiaggregatietherapie. Alle patiënten zullen worden behandeld volgens de voorgestelde protocollen van de nieuwste richtlijnen over STEMI (6). Patiënten zullen worden ingedeeld in twee groepen: hyperglykemische patiënten v/s normoglycemische, in beide groepen patiënten zal een analyse worden uitgevoerd van de fecale microbiota, pre PCI en pre duale plaatjesaggregatieremmende therapie. De microbiota wordt geëxtraheerd uit fecaal materiaal, vervolgens geprepareerd en vervolgens geanalyseerd. Het is in de klinische praktijk niet mogelijk om het overgrote deel van de darmbacteriën in het laboratorium te kweken, in vergelijking met de enorme hoeveelheid aanwezige micro-organismen. Dankzij de meest up-to-date technieken om het bacterieel DNA (Next Generation Sequencing) uit het fecesmateriaal te sequensen, is het nu mogelijk om de darmmicrobiota volledig en betrouwbaar te identificeren. Naast het identificeren van de aanwezige bacteriesoorten, kunnen auteurs ook een algemene gezondheidsgraad van de microbiota (of dysbiose) uitdrukken, de efficiëntie ervan bij de productie van sommige nuttige of schadelijke stoffen, de toereikendheid van de microbiota met betrekking tot enkele fundamentele functies waaraan een plaatsvervanger is en de neiging van de microbiota zelf tegen inflammatoire darmziekten, stofwisselingsziekten en veroudering. Het resultaat is een indrukwekkende hoeveelheid gegevens, een echte identiteitskaart van de microbiota, het Microbiota-paspoort genoemd.

Monstervoorbereiding en analyse. Monsters voor het bepalen van de microbiota worden verzameld uit fecaal materiaal en bewaard bij ultra-lage temperatuur (-80°C) om schade aan het oorspronkelijke monster te voorkomen. De sequentiebepaling van de microbiota zal worden uitgevoerd door het laboratorium voor microbiologie van de Universiteit van Campania "Luigi Vanvitelli". Voor de sequentiebepaling van de microbiota zullen we de "NextGeneration Sequencing" (NGS)-methode gebruiken, die de sequentiebepaling parallel van miljoenen DNA-fragmenten mogelijk maakt (25) door het gebruik van Illumina-machines (San Diego, CA). Het DNA zal uit deze monsters worden geëxtraheerd met behulp van een commerciële kitprocedure met hoge reproduceerbaarheid (Qiagen, Invitrogen). De uiteindelijke opbrengst en kwaliteit van het geëxtraheerde DNA zal worden bepaald met behulp van de NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA) en QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Het geëxtraheerde DNA zal worden geamplificeerd door PCR met de primers: forward: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 'en reverse: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), die gericht zijn op de hypervariabele regio V3 en V4 van de 16S rRNA-gen. Elke PCR-amplificatie zal worden uitgevoerd volgens een protocol voor de bereiding van 16S-bibliotheken voor metagenomische sequencing (Illumina, San Diego, CA). De amplificatieproducten zullen worden gekwantificeerd door de Qubit-fluoridator (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) en gegroepeerd in een equimolaire hoeveelheid van elk monster met een eindconcentratie van 2 nM. Een Phix-controlebibliotheek (Illumina) wordt aan de monsters toegevoegd. De gegroepeerde monsters worden vervolgens gesequenced op het MiSeq-platform (Illumina, San Diego, CA). De aldus verkregen gegevens zullen worden onderworpen aan kwaliteitscontroles door middel van bioinformatica-analyse met FastQC. Ten slotte zullen de gegevens worden geanalyseerd volgens de statistische tests die worden voorgesteld door de richtlijnen voor metagenomische sequencing. Patiëntgegevens worden met elkaar en in de loop van de tijd vergeleken met referentiedatabases. De evaluatie van de epigenetische activiteit van de microbiota en de biochemische doseringen van cytokines en vrije radicalen zal worden uitgevoerd in het laboratorium voor Farmacologie van de Universiteit van Campania "Luigi Vanvitelli. Met name voor de evaluatie van de epigenetische activiteit van de microbiota van elke individuele hyperglycemische v/s normoglycemische patiënt met STEMI, gaan we volgens het protocol QIAGEN (Italië) te werk met de extractie uit fecaal materiaal van het totale RNA, inclusief de lage -gewicht één molecuul (microRNA). De uiteindelijke opbrengst en kwaliteit van het geëxtraheerde RNA zal worden bepaald met behulp van de NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA). Via qRT-PCR (QIAGEN, Italië) zullen de expressieniveaus van de volgende fecale microRNA's worden gedetecteerd: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 en miR-663 betrokken bij de regulatie van de darmmicrobiota; miR-10a en miR-18b betrokken bij de regulatie van darmmicrobiota en metabolische ontsteking; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 en miR-223 betrokken bij metabolische ontsteking en signalering van insuline/IGF-1 (26). De metabole activiteit van de microbiota in elke individuele hyperglykemische v/s normoglycemische patiënt met STEMI zal worden geëvalueerd door bepaling van korteketenvetzuren (SCFA) uit fecale monsters: de niveaus van fecale SCFA, een product van bacteriële fermentatie, lijken te correleren met een verbetering van diabetes type 2 (27). De ontstekingsactiviteit van de microbiota zal worden geëvalueerd door de fecale niveaus van LPS (28-29), IL-1β en IL-6 (30-32) te bepalen, terwijl de oxidatieve activiteit door de analyse van fecale niveaus van ROS, SOD en GSH (33-34).

Het vervolgonderzoek van de auteurs is ontworpen om hyperglykemische v/s normoglycemische patiënten met STEMI in het "echte leven" te behandelen, zonder inmenging van de rigide regels die de generaliseerbaarheid van RCT's beperken. Daarom zullen alle patiënten na ontslag uit het ziekenhuis worden uitgenodigd om de controlebezoeken af ​​te leggen, zoals aangegeven door de richtlijnen voor de behandeling van post-STEMI-patiënten (6), bij de afdeling Cardiologie van de Universiteit van Campania "Luigi Vanvitelli" , en aan de VI Afdeling Interne Geneeskunde van de "Luigi Vanvitelli" Universiteit van Campanië. Alle patiënten zullen gedurende 12 maanden na het evenement worden gevolgd, als follow-up, om klinische evaluatie uit te voeren (ECG, inspanningstest, echocardiogram, glucosewaarden), zoals aangegeven in de richtlijnen voor de behandeling van STEMI-patiënten (6). Op deze tijdstippen zullen ook ontlastingsmonsters worden genomen voor de analyse van de microbiota. Bovendien zal bij het beheer en de beoordeling van de glykemische compensatie in de 12 maanden follow-up ook de arts worden betrokken om de HbA1c-waarden <7%, glykemie tussen 90 en 140 mg / dl en postprandiale glykemie <180 mg te houden /dl.

Cardiovasculaire eindpunten De cardiovasculaire eindpunten in beide cohorten omvatten hernieuwd myocardinfarct, heropname in het ziekenhuis voor coronaire hartziekte (re-stenose, stentimplantatie of aorto-coronaire bypass), hartfalen, beroerte, cardiale mortaliteit en alle doodsoorzaken . Het primaire samengestelde eindpunt zal bestaan ​​uit cardiovasculaire voorvallen, zoals een hartinfarct, ziekenhuisopname wegens hartfalen, beroerte of cardiale mortaliteit. Het secundaire eindpunt bestaat uit de evaluatie van de hartfunctie: vermindering van de ejectiefractie, toename van het volume van de linker ventrikel, vermindering van de coronaire perfusie. Alle sterfgevallen worden beoordeeld en geclassificeerd als cardiaal (overlijden veroorzaakt door IMA, ventriculaire aritmieën, refractair hartfalen) of niet-cardiaal. Alle revascularisaties worden geclassificeerd als vroeg (electieve revascularisatie binnen 60 dagen na coronaire angiografie) of laat. Alleen late revascularisaties worden geclassificeerd als cardiale gebeurtenissen, dus patiënten met vroege electieve revascularisatie worden uitgesloten van de analyse.

Statistische analyse De twee groepen zullen worden vergeleken met behulp van de Pearson χ2-test voor categorische variabelen en de Kruskal-Wallis-test voor continue variabelen. De covariabele kandidaten voor opname in het multivariabele model zullen worden geïdentificeerd door zich te concentreren op de factoren die significant zullen verschillen (P-waarde <0,05) in de univariate analyse tussen hyperglycemische v/s normoglycemische patiënten. Cox-regressie zal worden gebruikt om het sterftemodel te bouwen. De Hazard Ratio voor mortaliteit wordt aangepast voor leeftijd, BMI, cholesterol, LDL, triglyceriden- en aspirinetherapie, ticlopidine, combinatie van anti-aggreganten, β-blokkers, ACE-remmers of sartanen, antidiabetica, statines, tijdens ziekenhuisopname voor STEMI. Overlevingsanalyse gedurende het eerste jaar van STEMI zal worden uitgevoerd met behulp van de Kaplan-Meier-curve en de Cox-regressiemethode. De mortaliteitscurven zullen afzonderlijk worden verkregen voor hyperglykemische patiënten v/s normoglycemie, om te worden vergeleken met behulp van de log-rank-test. Alle tests worden als significant beschouwd als p-waarde <0,05. Alle analyses worden uitgevoerd in de twee studiepopulaties. Er zal een "propensity score"-analyse worden uitgevoerd met behulp van een "niet-zuinig" logistisch regressiemodel dat de uitkomsten van de hyperglycemische versus normoglycemische patiënten zal vergelijken. Er zullen meer variabelen in het model worden opgenomen, waaronder leeftijd, geslacht, diabetes, hypertensie, hypercholesterolemie, multivatziekte, chronisch nierfalen, TIMI pre-procedure flow, ejectiefractie en procedureel succes. De C-score geeft een goede discriminatie aan. Op basis van de "gematchte" monsters zal het Cox-model voor proportionele risico's worden gebruikt om de impact van hyperglycemie en van microbiotische flora-activiteit op mortaliteit tijdens de follow-up te bepalen. Voor alle analyses wordt SPSS (versie 21, IBM SPSS) gebruikt.

Steekproefomvang De steekproefomvang wordt berekend met een IBM PC-computer door GPOWER-software. Het grootte-effect zal worden berekend volgens de epidemiologische en interventionele onderzoeken die zijn uitgevoerd bij hyperglykemische patiënten. De steekproefomvang geschat op een globaal effect van 25% met een type I-fout van 0,05 en een power van 95% zal 200 deelnemers zijn, 100 voor de groep bestaande uit normoglycemische patiënten en 100 voor de groep hyperglykemische patiënten.