Mikrobiotan ja STEMI:n analyysi

Hyperglykemia on yleinen löydös potilailla, joilla on diagnosoitu akuutti sepelvaltimon oireyhtymä (ACS), ja se on riippumaton kuolleisuuden ennustaja potilailla, joilla on ja ei ole diabetesta (1–4). Vaikka perkutaaninen sepelvaltimon interventio (PCI) on ST-segmentin kohoaman sydäninfarktin (STEMI) kulmakivi (4–6), sydämen vajaatoiminnan, uusintainfarktin ja kuoleman ilmaantuvuus hyperglykeemisillä potilailla on edelleen merkittävä, ja kuolleisuus on yli 40 % vuoden kuluttua tapahtumasta (4-5). Itse asiassa restenoosi ja no-reflow-ilmiöt ovat yleisiä tapahtumia, jotka johtavat huonompiin kliinisiin tuloksiin hyperglykeemisillä potilailla, joille tehdään primaarinen PCI, ja jotka johtavat aterotromboottiseen embolisaatioon, lisääntyneeseen oksidatiiviseen stressiin ja tulehdukseen (3–6). Yrittäessään torjua hyperglykemian aiheuttamaa kuolleisuuden kasvua sepelvaltimoyksiköt ottivat käyttöön insuliiniprotokollat ​​normalisoidakseen verensokerin ACS:n aikana, ja sama insuliinihoito osoitti ristiriitaisia ​​tuloksia (7). Pienistä pilottitutkimuksista, kohtalaisista kliinisistä tutkimuksista ja meta-analyysistä saadut tiedot viittasivat insuliinihoidon hyötyihin (1-3,5). Toisaalta myöhemmät satunnaistetut kliiniset tutkimukset eivät ole vahvistaneet eloonjäämisen lisääntymistä (7, 8). Lisäksi, jos kaksoisantiaggregaatiohoito on tällä hetkellä PCI:llä hoidettujen STEMI-potilaiden terapeuttinen perusta (9), yhä useammin esiintyvä antiaggregaatiohoito ja verenvuotoilmiöt voivat heikentää heidän terapeuttista tehoaan (11-13). Siksi on todennäköistä, että yksilöllinen vaste kaksoisaggregaation estohoitoon ja hyperglykeeminen stressi voivat vaikuttaa resistenssimekanismeihin ja/tai johtaa mikrobioottisen kasviston aiheuttamaan farmakologisen toiminnan deaktivoitumisen lisääntymiseen. Termi mikrobiota tarkoittaa ekologisessa markkinarakossa olevien mikro-organismien genomien kokonaisuutta, jotka muodostavat "ihmisen mikrobiston" (14). Anatomisen alueen mukaan puhutaan suoliston, silmän, bukkaalin, emättimen mikrobiosta jne. MetaHIT-konsortion metagenomisin menetelmin toteuttama ihmisen suolistossa elävien mikro-organismien DNA-analyysi on tunnistanut yli 3 miljoonaa geeniä, 150 kertaa enemmän kuin ihmislajin (16-21). Lisäksi sydän- ja verisuonitaudit, kuten verenpainetauti ja sepelvaltimotauti, ovat vahvasti ehdollisia Enterobacteriaceae-, Firmicutes- ja Lattobacilli-bakteerien esiintymisestä suolistossa, mikä voi määrittää niiden alkamisen (22). Tässä yhteydessä ulosteen mikrobiotan analyysiä ennen PCI:tä, sairaalasta kotiutuksen yhteydessä ja seurannassa voidaan pitää hyödyllisenä hyperglykeemisten potilaiden tunnistamisessa, joilla on muutoksia metabolis-oksidatiivisissa prosesseissa, ja pro-tromboottinen korrelaatio huonompaan toimenpiteen jälkeiseen ennusteeseen (23). ). Ulosteen mikrobiosta näytteiden oton helppous ja merkittävä vaikutus tiedeyhteisöön ja rutiininomaiseen kliiniseen käytäntöön pakottavat meidät vaatimaan kliinistä tutkimusta sekä mikrobiotan genomista, metabolista ja soluanalyysiä sekä uuttamaan mahdollisimman paljon mahdollisimman paljon tietoa hyperglykeemisistä potilaista, joilla on STEMI. Tätä tutkimusta ei ole koskaan ehdotettu tieteellisessä tutkimuksessa ja kliinisessä käytännössä STEMI:n vuoksi sairaalahoidossa olevien hyperglykeemisten potilaiden osalta. Todellakin, suuri määrä todisteita viittaa siihen, että hyperglykemia aiheuttaa lisääntyvää oksidatiivisen stressin ja tulehduksen tuotantoa sekä ateroskleroottisessa plakissa että veritulpassa, ja siksi sillä on keskeinen rooli STEMI:n huonompien tulosten määrittämisessä. Siksi ulosteen mikrobiotan analyysi tapahtuman aikana voisi teoriassa tunnistaa hyperglykeemiset potilaat, joilla on hyperglykemian aiheuttama liiallinen tulehduksellinen ja oksidatiivinen sävy, hoitava vastustuskyky kaksinkertaiselle antiaggregaatiohoidolle ja sepelvaltimoiden stentaukselle sekä pro-tromboottisia ilmiöitä PCI:n sepelvaltimon reperfuusion jälkeen. Siksi kirjoittajat suorittavat tutkimuksen analysoidakseen mikrobiota potilailla, joilla on akuutti hyperglykeeminen ja normoglykeeminen sepelvaltimotauti.

TAVOITTEET Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on arvioida mahdollisia muutoksia mikrobiotassa ja sen aktiivisuudessa ulostemateriaalissa, joka on otettu ennen PCI:tä sekä 6 ja 12 kuukauden jälkeen potilailla, joilla on hyperglykeeminen STEMI, sekä arvioida, voivatko muutokset mikrobiotassa olla yhteydessä toisiinsa. 12 kuukauden ennusteeseen.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT Potilaat Tämä on kohorttitutkimus, jossa tutkitaan mikrobiotan mahdollisten muutosten vaikutuksia ja sen aktiivisuutta ulostenäytteissä, jotka on otettu potilailta, joilla on hyperglykeeminen STEMI v/s normoglykeeminen. Näitä potilaita hoidetaan rutiininomaisten "todellisen elämän" terapeuttisten käytäntöjen mukaisesti, jotka on hyväksytty Campanian "Luigi Vanvitelli" -yliopiston kardiologian osastolla. Sairaalasta kotiutumisen jälkeen kaikki potilaat kutsutaan suorittamaan kontrollikäyntejä post-STEMI-potilaiden hoitoa koskevien ohjeiden (6) mukaisesti Campanian yliopiston Luigi Vanvitellin kardiologian osastolle ja klo. Luigi Vanvitellin Campanian yliopiston VI sisätautien osasto. Kaikkia potilaita seurataan 12 kuukauden ajan tapahtuman jälkeen seurantana. American Heart Associationin tuoreen määritelmän mukaan hyperglykemia määritellään paastoveren glykeemisillä tasoilla > 140 mg / dl (1, 9). Kaikille potilaille, joilla oireet alkavat 12 tunnin sisällä ja ST-segmentin nousu 1 mm kahdessa tai useammassa vierekkäisessä ääreisjohdossa tai vähintään 2 mm kahdessa tai useammassa vierekkäisessä sydämen sydänjohdossa tai uusi vasemman haaran katkos, harkitaan PCI:tä. Osallistumiskriteereitä ovat: yli 18-vuotias ikä ja pääsy STEMIn ensimmäiseen jaksoon. Potilaat, joiden vasemman kammion ejektiofraktio <25 % ja joilla on aiempi IMA tai aiempi PCI ja/tai ohitus, suljetaan pois. Jokainen otetaan mukaan tutkimukseen allekirjoitettuaan tietoisen suostumuksen. Rutiininomaiset hematologiset analyysit tehdään vastaanottohetkellä, ennen lääkehoidon harjoittamista ja mahdollista sepelvaltimotutkimusta sekä 6 ja 12 kuukauden kuluttua. Arvioimme näinä aikoina otetuista verinäytteistä trimetyyliamiini-N-oksidia (TMAO), joka on bakteerien aineenvaihdunnan tuote, jonka kohonneet seerumitasot liittyvät haitallisiin kardiovaskulaarisiin tapahtumiin (24). Lisäksi ennen PCI:tä sekä 6 ja 12 kuukautta myöhemmin otetaan ulostenäyte, jonka perusteella mikrobiota analysoidaan. Tutkimus tehdään Helsingin julistuksen periaatteiden mukaisesti.

Toimenpide Tässä tutkimuksessa kirjoittajat arvioivat STEMI-potilaiden kohortin, jotka on otettu Campanian "Luigi Vanvitelli" -yliopiston kardiologiaosastolle ja joita hoidetaan kaksois-aggregaatiohoidolla. Kaikkia potilaita hoidetaan uusimpien STEMI-ohjeiden (6) ehdotettujen protokollien mukaisesti. Potilaat luokitellaan kahteen ryhmään: hyperglykeemiset potilaat v/s normoglykeemiset, molemmissa potilasryhmissä suoritetaan ulosteen mikrobiston analyysi, pre-PCI ja pre duaalinen verihiutaleiden vastainen hoito. Mikrobiota uutetaan ulostemateriaalista, valmistetaan ja analysoidaan myöhemmin. Kliinisessä käytännössä ei ole mahdollista viljellä laboratoriossa suurta osaa suoliston bakteereista verrattuna valtavaan määrään mikro-organismeja. Ulostemateriaalista uutetun bakteeri-DNA:n (Next Generation Sequencing) uusimpien sekvensointitekniikoiden ansiosta on nyt mahdollista täydellinen ja luotettava suoliston mikrobiston tunnistaminen. Esiintyvien bakteerilajien tunnistamisen lisäksi kirjoittajat pystyvät ilmaisemaan myös mikrobiotan (tai dysbioosin) yleisen terveysasteen, sen tehokkuuden joidenkin hyödyllisten tai haitallisten aineiden tuotannossa, mikrobiotan riittävyyden joidenkin perustoimintojen suhteen. jonka sijaisena on mikrobiotan itsensä taipumus tulehduksellisia suolistosairauksia, aineenvaihduntasairauksia ja ikääntymistä vastaan. Tuloksena on vaikuttava määrä tietoa, todellinen mikrobiotan henkilöllisyystodistus, nimeltään Microbiota passi.

Näytteen valmistelu ja analysointi. Näytteet mikrobiotan sekvensointia varten kerätään ulostemateriaalista ja säilytetään erittäin alhaisessa lämpötilassa (-80°C), jotta vältetään alkuperäisen näytteen vaurioituminen. Mikrobiootan sekvensoinnin suorittaa Campanian yliopiston mikrobiologian laboratorio "Luigi Vanvitelli". Mikrobiootan sekvensointiin käytämme "NextGeneration Sequencing" (NGS) -menetelmää, joka mahdollistaa miljoonien DNA-fragmenttien rinnakkaisen sekvensoinnin (25) Illumina-koneiston (San Diego, CA) avulla. DNA uutetaan näistä näytteistä käyttämällä korkean toistettavuuden kaupallista kittimenettelyä (Qiagen, Invitrogen). Uutetun DNA:n lopullinen saanto ja laatu määritetään käyttämällä NanoDrop ND-1000 spektrofotometriä (ThermoScientific, Waltham, MA) ja QubitFluorometer 1.0:aa (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Uutettu DNA monistetaan PCR:llä alukkeilla: eteenpäin: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 'ja käänteinen: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al. 2013), jotka kohdistuvat 16S:n hypervariaabeliin alueisiin V3 ja V4. rRNA geeni. Jokainen PCR-monistus suoritetaan protokollan mukaisesti 16S-kirjastojen valmistelua varten metagenomista sekvensointia varten (Illumina, San Diego, CA). Monistustuotteet kvantifioidaan Qubit-fluoridaattorilla (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) ja ryhmitellään kunkin näytteen ekvimolaariseen määrään lopullisen pitoisuuden ollessa 2 nM. Phix-kontrollikirjasto (Illumina) lisätään näytteisiin. Ryhmitetyt näytteet sekvensoidaan sitten MiSeq Platformilla (Illumina, San Diego, CA). Näin saadut tiedot alistetaan laadunvalvontaan FastQC:n bioinformatiikan analyysillä. Lopuksi tiedot analysoidaan metagenomisen sekvensoinnin ohjeiden ehdottamien tilastollisten testien mukaisesti. Potilastietoja verrataan keskenään ja ajan mittaan viitetietokantoihin. Mikrobiootan epigeneettisen aktiivisuuden sekä sytokiinien ja vapaiden radikaalien biokemiallisten annosten arviointi suoritetaan Campanian yliopiston farmakologian laboratoriossa "Luigi Vanvitelli. Erityisesti kunkin yksittäisen hyperglykeemisen v/s normoglykeemisen STEMI-potilaan mikrobiston epigeneettisen aktiivisuuden arvioimiseksi jatkamme QIAGEN-protokollan (Italia) mukaisesti poistamalla ulostemateriaalista kokonais-RNA, mukaan lukien alhainen RNA. -paino yksi molekyyli (mikroRNA). Uutetun RNA:n lopullinen saanto ja laatu määritetään käyttämällä NanoDrop ND-1000 -spektrofotometriä (ThermoScientific, Waltham, MA). qRT-PCR:n (QIAGEN, Italia) avulla havaitaan seuraavien ulosteen mikro-RNA:iden ilmentymistasot: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 ja miR-663 osallistuvat suoliston mikrobiotan säätelyyn; miR-10a ja miR-18b osallistuvat suoliston mikrobiotan ja metabolisen tulehduksen säätelyyn; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 ja miR-223 osallistuvat metaboliseen tulehdukseen ja signaalin välittämiseen insuliini/IGF-1 (26). Mikrobiootan metabolinen aktiivisuus kussakin yksittäisessä hyperglykeemisessä v/s normoglykeemisessä STEMI-potilaassa arvioidaan määrittämällä lyhytketjuisia rasvahappoja (SCFA) ulostenäytteistä: ulosteen SCFA:n, bakteerien fermentaation tuotteen, tasot näyttävät korreloivan tyypin 2 diabeteksen paraneminen (27). Mikrobiootan tulehduksellista aktiivisuutta arvioidaan määrittämällä LPS:n (28-29), IL-1β:n ja IL-6:n (30-32) ulostetasot, kun taas oksidatiivista aktiivisuutta analysoimalla ulosteen ROS-, SOD- ja GSH (33-34).

Seuranta Kirjoittajien tutkimus on suunniteltu hoitamaan hyperglykeemisiä v/s normoglykeemisiä STEMI-potilaita "todellisessa elämässä" ilman, että jäykät säännöt, jotka rajoittavat RCT:iden yleistävyyttä, puuttuvat. Siksi kaikki potilaat kutsutaan sairaalasta kotiutumisen jälkeen suorittamaan kontrollikäyntejä Campanian yliopiston Luigi Vanvitellin kardiologian osastolla post-STEMI-potilaiden hoitoa koskevien ohjeiden (6) mukaisesti. ja Campanian "Luigi Vanvitelli" -yliopiston VI sisätautien osastolla. Kaikkia potilaita seurataan seurannana 12 kuukauden ajan tapahtuman jälkeen kliinisen arvioinnin (EKG, rasitustesti, sydämen kaikukuvaus, glukoositasot) harjoittamiseksi STEMI-potilaiden hoitoa koskevien ohjeiden mukaisesti (6). Tänä aikana otetaan myös ulostenäytteitä mikrobiotan analysointia varten. Lisäksi lääkäri osallistuu glykeemisen kompensaation hallintaan ja arviointiin 12 kuukauden seurantajakson aikana, jotta HbA1c-tasot pysyisivät alle 7 %, glykemia välillä 90-140 mg/dl ja aterian jälkeinen glykemia <180 mg. / dl.

Kardiovaskulaariset päätepisteet Kardiovaskulaariset päätepisteet molemmissa kohortteissa sisältävät sydänlihaksen uusintainfarktin, uudelleen sairaalahoitoon sepelvaltimotaudin vuoksi (uudelleen ahtauma, stentin istutus tai aorto-sepelvaltimon ohitus), sydämen vajaatoiminta, aivohalvaus, sydänkuolleisuus ja kaikki kuolleisuuden syyt . Ensisijainen yhdistetty päätepiste koostuu kardiovaskulaarisista tapahtumista, kuten sydäninfarkti, sairaalahoito sydämen vajaatoiminnan vuoksi, aivohalvaus tai sydänkuolleisuus. Toissijainen päätepiste koostuu sydämen toiminnan arvioinnista: ejektiofraktion väheneminen, vasemman kammion tilavuuden kasvu, sepelvaltimon perfuusion väheneminen. Kaikki kuolemat tarkistetaan ja luokitellaan sydänperäisiksi (IMA:n aiheuttama kuolema, kammiorytmihäiriöt, refraktaarinen sydämen vajaatoiminta) tai ei-sydämellisiin. Kaikki revaskularisaatiot luokitellaan varhaisiksi (elektiivinen revaskularisaatio 60 päivän sisällä sepelvaltimon angiografiasta) tai myöhäisiksi. Vain myöhäiset revaskularisaatiot luokitellaan sydäntapahtumiin, joten potilaat, joilla on varhainen elektiivinen revaskularisaatio, jätetään analyysin ulkopuolelle.

Tilastollinen analyysi Näitä kahta ryhmää verrataan käyttämällä Pearson χ2 -testiä kategorisille muuttujille ja Kruskal-Wallis -testiä jatkuville muuttujille. Monimuuttujamalliin pääsyn kovariaattiehdokkaat tunnistetaan keskittymällä niihin tekijöihin, jotka eroavat merkittävästi (P-arvo <0,05) yksimuuttujaanalyysissä hyperglykeemisten v/s normoglykeemisten potilaiden välillä. Cox-regressiota käytetään kuolleisuusmallin rakentamiseen. Kuolleisuuden riskisuhdetta mukautetaan iän, BMI:n, kolesterolin, LDL:n, triglyseridien ja aspiriinihoidon, tiklopidiinin, antiaggreganttien, beetasalpaajien, ACE-estäjien tai sartaanien, diabeteslääkkeiden, statiinien yhdistelmän mukaan STEMI-sairaalahoidon aikana. STEMI:n ensimmäisen vuoden eloonjäämisanalyysi suoritetaan Kaplan-Meier-käyrällä ja Cox-regressiomenetelmällä. Kuolleisuuskäyrät saadaan erikseen hyperglykeemisistä potilaista v/s normoglykemia, ja niitä verrataan log-rank-testillä. Kaikki testit katsotaan merkitseviksi, jos p-arvo <0,05. Kaikki analyysit suoritetaan kahdessa tutkimuspopulaatiossa. "Taipumispistemäärä" -analyysi suoritetaan käyttämällä "ei-niukkaa" logistista regressiomallia, joka vertaa hyperglykeemisten v/s normoglykeemisten potilaiden tuloksia. Malliin sisällytetään lisää muuttujia, mukaan lukien ikä, sukupuoli, diabetes, verenpainetauti, hyperkolesterolemia, monisuonisairaus, krooninen munuaisten vajaatoiminta, TIMI-toimenpiteen edeltävä virtaus, ejektiofraktio ja toimenpiteen onnistuminen. C-pisteet osoittavat hyvää syrjintää. Coxin suhteellista riskimallia käytetään "vastaavien" näytteiden perusteella määrittämään hyperglykemian ja mikrobioflooran vaikutus kuolleisuuteen seurannan aikana. Kaikissa analyyseissä käytetään SPSS:ää (versio 21, IBM SPSS).

Näytteen koko Näytteen koko lasketaan IBM PC -tietokoneella GPOWER-ohjelmistolla. Kokovaikutus lasketaan hyperglykemiapotilailla tehtyjen epidemiologisten ja interventiotutkimusten perusteella. Otoskoko, joka on arvioitu globaalilla vaikutuksella 25 % tyypin I virheen ollessa 0,05 ja teholla 95 %, on 200 osallistujaa, 100 normoglykeemisten potilaiden ryhmälle ja 100 hyperglykeemisten potilaiden ryhmälle.