A mikrobiota és a STEMI elemzése

A hiperglikémia gyakori jelenség az akut koronária szindrómával (ACS) diagnosztizált betegeknél, és független előrejelzője a halálozásnak cukorbetegek és nem cukorbetegek esetében (1-4). Bár a percutan coronaria intervenció (PCI) az ST-elevációs szívinfarktus (STEMI) sarokköve (4-6), a szívelégtelenség, az újrainfarktus és a halálozás incidenciája a hiperglikémiás betegekben továbbra is jelentős, a mortalitás meghaladja a 40-et. % egy évvel az esemény után (4-5). Valójában a restenosis és a no-reflow jelenségek gyakori események, amelyek rosszabb klinikai kimenetelhez vezetnek az elsődleges PCI-n átesett hiperglikémiás betegeknél, és atherothromboticus embolizációt, fokozott oxidatív stresszt és gyulladást eredményeznek (3-6). A hiperglikémia okozta halálozás növekedésének ellensúlyozása érdekében a koszorúér egységek inzulin protokollokat vezettek be a vércukorszint normalizálására az ACS alatt, és ugyanaz az inzulinkezelés ellentmondó eredményeket mutatott (7). Kisebb kísérleti vizsgálatokból, mérsékelt klinikai vizsgálatokból és egy metaanalízisből származó adatok az inzulinterápia előnyeire utaltak (1-3,5). Másrészt a későbbi randomizált klinikai vizsgálatok nem erősítették meg a túlélés növekedését (7, 8). Sőt, ha jelenleg a kettős anti-aggregáció terápia a PCI-vel kezelt STEMI-s betegek terápiás alapja (9), az egyre gyakoribb antiaggregációs terápia és vérzéses jelenségek csökkenthetik terápiás hatékonyságukat (11-13). Ezért valószínű, hogy a kettős anti-aggregációs terápiára adott egyéni válasz és a hiperglikémiás stressz befolyásolhatja a rezisztencia mechanizmusokat, és/vagy a mikrobiotikus flóra által okozott farmakológiai funkcionális dezaktiváció fokozódásához vezethet. A mikrobiota kifejezés a mikroorganizmusok genomjainak összességét jelöli, amelyek egy ökológiai résben találhatók, és amelyek az „emberi mikrobiótát” alkotják (14). A vizsgált anatómiai körzet szerint bél-, szem-, bukkális, hüvelyi mikrobiotáról, stb. A MetaHIT konzorcium által metagenomikus módszerekkel végrehajtott, az emberi bélrendszerben élő mikroorganizmusok DNS-elemzése több mint 3 millió gént azonosított, ami 150-szerese az emberi fajénak (16-21). Ezenkívül a szív- és érrendszeri betegségeket, például a magas vérnyomást és a koszorúér-betegséget erősen befolyásolja az Enterobacteriaceae, Firmicutes és Lattobacillusok jelenléte a bélben, amelyek meghatározhatják a megjelenésüket (22). Ebben az összefüggésben a széklet mikrobiota elemzése a PCI előtt, a kórházi elbocsátáskor és a nyomon követéskor hasznosnak tekinthető a hiperglikémiás betegek azonosításában, akiknél az anyagcsere-oxidatív folyamatok megváltoztak, és a pro-trombotikus korreláció a rosszabb műtét utáni prognózissal (23) ). A széklet-mikrobióta minták egyszerű beszerzése, valamint a tudományos közösségre és a rutin klinikai gyakorlatra gyakorolt ​​jelentős hatás arra késztet bennünket, hogy ragaszkodjunk a klinikai kutatáshoz, a mikrobiota genomiális, metabolikus és sejtes elemzéséhez, és minél többet kinyerjünk. STEMI-ben szenvedő hiperglikémiás betegeknél a lehető legjobb tájékoztatást. Ezt a vizsgálatot soha nem javasolták a tudományos kutatásban és a klinikai gyakorlatban STEMI miatt kórházi hiperglikémiás betegeknél. Valójában sok bizonyíték utal arra, hogy a hiperglikémia oxidatív stressz és gyulladás fokozódását okozza, mind az atheroscleroticus plakkokban, mind a thrombusban, és ezért központi szerepet játszik a STEMI rosszabb kimeneteleinek meghatározásában. Ezért a széklet mikrobiota elemzése az esemény során elméletileg azonosíthatja a hiperglikémiás betegeket, akiknél a hiperglikémia okozta túlzott gyulladásos és oxidatív tónus, a kettős anti-aggregációs terápiával és a koszorúér-stenttel szembeni kondicionáló rezisztencia, valamint a PCI-vel végzett koszorúér-reperfúziót követően pro-trombotikus jelenségek kondicionálása. Ezért a szerzők tanulmányt fognak végezni az akut hiperglikémiás és normoglikémiás koszorúér-szindrómában szenvedő betegek mikrobiotájának elemzésére.

CÉLKITŰZÉSEK A tanulmány elsődleges célja a PCI előtt, illetve 6 és 12 hónap után vett bélsárban a mikrobiotában és aktivitásában bekövetkezett változások értékelése hiperglikémiás STEMI-ben szenvedő betegek esetében, valamint annak értékelése, hogy a mikrobióta változásai összefüggésbe hozhatók-e. a 12 hónapos prognózishoz.

ANYAG ÉS MÓDSZER Betegek Ez egy kohorsz vizsgálat a mikrobiotában és annak aktivitásában bekövetkező lehetséges változások hatásainak vizsgálatára hiperglikémiás STEMI v/s normoglykaemiás betegektől vett székletmintákban. Ezeket a betegeket a rutin "valódi élet" terápiás gyakorlatok szerint kezelik, amelyeket a Campania "Luigi Vanvitelli" Egyetem kardiológiai osztályán fogadtak el. A kórházból való elbocsátást követően minden beteget felkérnek, hogy végezze el a kontrollviziteket, amint azt a poszt-STEMI-betegek kezelésére vonatkozó irányelvek (6) jelzik, a Campania "Luigi Vanvitelli" egyetem kardiológiai osztályán, és a Campaniai Luigi Vanvitelli Egyetem VI Belgyógyászati ​​Osztálya. Az eseményt követő 12 hónapig minden beteget megfigyelés alatt tartanak. Az American Heart Association legújabb meghatározása szerint a hiperglikémiát a 140 mg/dl-nél nagyobb éhgyomri vércukorszint határozza meg (1, 9). Minden olyan betegnél, akinél a tünetek 12 órán belül jelentkeznek, és az ST szegmens 1 mm-rel emelkedett 2 vagy több összefüggő perifériás vezetékben, vagy legalább 2 mm-rel 2 vagy több összefüggő precordialis vezetékben, vagy újonnan jelentkező bal ági blokk, megfontolandó a PCI vizsgálata. A részvételi feltételek a következők: 18 év feletti életkor és a STEMI első epizódjára való felvétel. Azok a betegek, akiknek bal kamrai ejekciós frakciója <25%, korábbi IMA vagy korábbi PCI és/vagy by-pass kezelésben részesült, kizárásra kerül. Mindegyiket bevonják a vizsgálatba, miután aláírták a beleegyezésüket. Az átvételkor, a gyógyszeres kezelés és az esetleges koszorúér-vizsgálat megkezdése előtt, valamint 6 és 12 hónap elteltével rutin hematológiai elemzésre kerül sor. Az ekkor vett vérminta egy alikvot részén értékeljük a trimetilamin-N-oxidot (TMAO), a bakteriális anyagcsere termékét, amelynek emelkedett szérumszintje káros kardiovaszkuláris eseményekkel jár (24). Ezenkívül a PCI előtt, valamint 6 és 12 hónappal később székletmintát vesznek, amelyen a mikrobiotát utólag elemzik. A kutatás a Helsinki Nyilatkozat alapelvei szerint zajlik majd.

Eljárás Ebben a tanulmányban a szerzők a Campania "Luigi Vanvitelli" Egyetem kardiológiai osztályára felvett és kettős aggregációgátló terápiával kezelt STEMI-s betegek egy csoportját értékelik. Minden beteget a STEMI-re vonatkozó legújabb irányelvek (6) javasolt protokolljai szerint kezelnek. A betegeket két csoportba soroljuk: hiperglikémiás betegek v/s normoglykaemiás betegek, mindkét betegcsoportban a széklet mikrobiota elemzése, a pre PCI és a pre duális thrombocyta-aggregáció terápia. A mikrobiótát a székletből kivonják, majd előkészítik és ezt követően elemzik. A klinikai gyakorlatban nem lehetséges a bélbaktériumok túlnyomó többségének laboratóriumi tenyésztése, szemben a jelenlévő mikroorganizmusok óriási mennyiségével. A székletanyagból kinyert bakteriális DNS szekvenálásának legkorszerűbb technikáinak (Next Generation Sequencing) köszönhetően ma már lehetséges a bélmikrobióta teljes és megbízható azonosítása. A jelenlévő baktériumfajok azonosítása mellett a szerzők képesek kifejezni a mikrobiota (vagy dysbiosis) általános egészségi fokát, annak hatékonyságát egyes hasznos vagy káros anyagok előállításában, a mikrobiota megfelelőségét néhány alapvető funkció tekintetében. melynek helyettese és maga a mikrobióta gyulladásos bélbetegségekkel, anyagcsere-betegségekkel és öregedéssel szembeni hajlama. Az eredmény lenyűgöző mennyiségű adat, a mikrobiota valódi személyazonosító igazolványa, a Microbiota útlevél.

Minta előkészítés és elemzés. A mikrobiota szekvenálására szolgáló mintákat a székletből gyűjtik, és ultraalacsony hőmérsékleten (-80°C) tárolják, hogy elkerüljék az eredeti minta károsodását. A mikrobiota szekvenálását a Campaniai Egyetem "Luigi Vanvitelli" Mikrobiológiai Laboratóriuma végzi majd. A mikrobiota szekvenálásához a "NextGeneration Sequencing" (NGS) módszert fogjuk használni, amely lehetővé teszi több millió DNS-fragmens (25) párhuzamos szekvenálását Illumina gépezet (San Diego, CA) segítségével. A DNS-t ezekből a mintákból nagy reprodukálhatóságú kereskedelmi kit eljárással (Qiagen, Invitrogen) vonják ki. Az extrahált DNS végső hozamát és minőségét a NanoDrop ND-1000 spektrofotométer (ThermoScientific, Waltham, MA) és a QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) segítségével határozzuk meg. Az extrahált DNS-t PCR-rel amplifikáljuk a következő primerekkel: előre: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 ' és fordított: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al. 2013), amelyek a 16S V3 és V4 hipervariábilis régióját célozzák. rRNS gén. Minden PCR-amplifikációt a metagenomikus szekvenáláshoz szükséges 16S-könyvtárak (Illumina, San Diego, CA) előkészítésére szolgáló protokoll szerint hajtanak végre. Az amplifikációs termékeket a Qubit fluoridator (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) segítségével számszerűsítjük, és minden mintából ekvimoláris mennyiségben csoportosítjuk 2 nM végső koncentrációval. A mintákhoz egy Phix kontrollkönyvtárat (Illumina) adunk. A csoportosított mintákat ezután a MiSeq Platformon (Illumina, San Diego, CA) szekvenálják. Az így kapott adatokat a FastQC-vel végzett bioinformatikai elemzéssel minőségellenőrzésnek vetjük alá. Végül az adatokat a metagenomikus szekvenálásra vonatkozó irányelvek által javasolt statisztikai tesztek szerint elemezzük. A betegek adatait összehasonlítják egymással és idővel referenciaadatbázisokkal. A mikrobiota epigenetikai aktivitásának, valamint a citokinek és szabad gyökök biokémiai dózisának értékelését a Campania Egyetem Farmakológiai Laboratóriumában, "Luigi Vanvitelli" végzik. Különösen az egyes STEMI-s hiperglikémiás v/s normoglykaemiás betegek mikrobiótájának epigenetikai aktivitásának értékeléséhez a QIAGEN (Olaszország) protokoll szerint járunk el a teljes RNS ürülékből történő extrakciójával, beleértve az alacsony RNS-t is. -egy molekulasúlyú (mikroRNS). Az extrahált RNS végső hozamát és minőségét NanoDrop ND-1000 spektrofotométerrel (ThermoScientific, Waltham, MA) határozzuk meg. A qRT-PCR (QIAGEN, Olaszország) segítségével a következő széklet mikroRNS-ek expressziós szintjeit detektálják: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 és miR-663 részt vesz a bél mikrobiota szabályozásában; a miR-10a és a miR-18b részt vesz a bélmikrobióta és a metabolikus gyulladás szabályozásában; A miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 és miR-223 részt vesz a metabolikus gyulladásban és az inzulin/IGF-1 jelátvitelében (26). A mikrobiota metabolikus aktivitását minden egyes hiperglikémiás v/s normoglykaemiás STEMI-ben szenvedő betegben a székletmintákból származó rövid szénláncú zsírsavak (SCFA) meghatározásával értékeljük: a széklet SCFA-szintje, amely a bakteriális fermentáció terméke, úgy tűnik, korrelál a 2-es típusú cukorbetegség javulása (27). A mikrobiota gyulladásos aktivitását az LPS (28-29), IL-1β és IL-6 (30-32) székletszintjének meghatározásával, míg az oxidatív aktivitását a széklet ROS, SOD és SOD szintjének elemzésével értékeljük. GSH (33-34).

A szerzők nyomon követési vizsgálata a hiperglikémiás v/s normoglykaemiás, STEMI-ben szenvedő betegek „valódi életben történő” kezelésére készült, anélkül, hogy a merev szabályok beavatkoznának, amelyek korlátozzák az RCT-k általánosíthatóságát. Ezért a kórházból való hazabocsátás után minden beteget felkérnek, hogy végezze el a kontroll látogatásokat, amint azt a poszt-STEMI-betegek kezelésére vonatkozó irányelvek (6) jelzik, a Campania "Luigi Vanvitelli" egyetem kardiológiai osztályán. , valamint a Campania "Luigi Vanvitelli" Egyetem VI Belgyógyászati ​​Osztályán. Az esemény után 12 hónapig minden beteget megfigyelés alatt tartanak, hogy gyakorolják a klinikai értékelést (EKG, terhelési teszt, echokardiogram, glükózszint), amint azt a STEMI-betegek kezelésére vonatkozó irányelvek is jelzik (6). Ezekben az időpontokban székletmintákat is vesznek a mikrobiota elemzéséhez. Ezenkívül a glikémiás kompenzáció kezelésében és értékelésében a követés 12 hónapjában az orvos is részt vesz annak érdekében, hogy a HbA1c-szintet <7%, a glikémiát 90 és 140 mg/dl között, a posztprandiális glikémiát pedig 180 mg alatt tartsák. / dl.

Kardiovaszkuláris végpontok Mindkét kohorsz kardiovaszkuláris végpontjai közé tartozik a szívizom-újrainfarktus, a koszorúér-betegség miatti újbóli kórházi kezelés (re-stenosis, stent beültetés vagy aorto-koszorúér bypass), szívelégtelenség, stroke, szívhalálozás és a halálozás összes oka. . Az elsődleges összetett végpont a kardiovaszkuláris eseményekből áll, mint például a szívinfarktus, a szívelégtelenség miatti kórházi kezelés, a stroke vagy a szívhalálozás. A másodlagos végpont a szívműködés értékelése: az ejekciós frakció csökkenése, a bal kamra térfogatának növekedése, a koszorúér perfúzió csökkentése. Minden halálesetet felülvizsgálnak, és kardiálisnak (IMA okozta halálozás, kamrai aritmiák, refrakter szívelégtelenség) vagy nem szívbetegségnek minősítenek. Minden revascularisatio korai (a koszorúér angiográfia után 60 napon belüli elektív revascularisatió) vagy késői revascularisatiónak minősül. Csak a késői revascularisatiókat soroljuk kardiális események közé, így a korai elektív revascularisatióval rendelkező betegeket kizárjuk az elemzésből.

Statisztikai elemzés A két csoportot a kategorikus változók esetében a Pearson χ2 teszttel, a folytonos változókra a Kruskal-Wallis teszttel hasonlítjuk össze. A többváltozós modellbe való belépéshez szükséges kovariáns jelölteket úgy azonosítjuk, hogy azokra a tényezőkre koncentrálunk, amelyek szignifikánsan különböznek egymástól (P-érték <0,05) a hiperglikémiás v/s normoglikémiás betegek egyváltozós elemzésében. A halandósági modell felépítéséhez Cox-regressziót kell használni. A halálozási kockázati arányt az életkor, a BMI, a koleszterin, az LDL, a triglicerid és az aszpirin terápia, a tiklopidin, az antiaggregánsok, a β-blokkolók, az ACE-gátlók vagy a sartanok kombinációja, az antidiabetikumok, a sztatinok alapján korrigálják a STEMI miatti kórházi kezelés során. A STEMI első évének túlélési elemzése a Kaplan-Meier-görbe és a Cox-regressziós módszer segítségével történik. A mortalitási görbéket külön kapjuk meg a hiperglikémiás betegek és a normoglikémiás betegek esetében, és a log-rank teszttel hasonlítjuk össze. Minden teszt szignifikánsnak minősül, ha p <0,05. Minden elemzést a két vizsgálati populációban kell elvégezni. A „hajlampontszám” elemzését „nem takarékos” logisztikus regressziós modell segítségével végezzük, amely összehasonlítja a hiperglikémiás v/s normoglikémiás betegek eredményeit. A modellben további változók szerepelnek majd, beleértve az életkort, nemet, cukorbetegséget, magas vérnyomást, hiperkoleszterinémiát, több érbetegséget, krónikus veseelégtelenséget, a TIMI-eljárás előtti áramlást, az ejekciós frakciót és az eljárás sikerességét. A C-pontszám jó diszkriminációt jelez. Az „egyeztetett” minták alapján a Cox arányos kockázati modellt fogják használni a hiperglikémia és a mikrobiológiai flóra aktivitásának mortalitásra gyakorolt ​​hatásának meghatározására a követés során. Az összes elemzéshez az SPSS-t (21-es verzió, IBM SPSS) fogják használni.

Mintaméret A minta mérete IBM PC számítógéppel kerül kiszámításra a GPOWER szoftverrel. A mérethatás kiszámítása a hiperglikémiás betegeken végzett epidemiológiai és intervenciós vizsgálatok alapján történik. A 25%-os globális hatásra becsült mintanagyság 0,05-ös I-es típusú hibával és 95%-os erővel 200 résztvevő lesz, 100 a normoglykaemiás betegek és 100 a hiperglikémiás betegek csoportja.