Анализ микробиоты и ИМпST

Гипергликемия часто встречается у пациентов с диагнозом острый коронарный синдром (ОКС) и является независимым предиктором смертности у пациентов с диабетом и без него (1–4). Хотя чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) является краеугольным камнем инфаркта миокарда с подъемом сегмента ST (ИМпST) (4-6), частота сердечной недостаточности, повторного инфаркта и смерти у пациентов с гипергликемией остается значительной, смертность составляет более 40 % через год после события (4-5). На самом деле, рестеноз и феномен отсутствия рефлюкса являются обычными явлениями, ведущими к ухудшению клинических исходов у пациентов с гипергликемией, перенесших первичное ЧКВ, и приводят к атеротромботической эмболизации, усилению окислительного стресса и воспалению (3-6). В попытке противодействовать увеличению смертности от гипергликемии в коронарных отделениях были внедрены инсулиновые протоколы для нормализации уровня глюкозы в крови при ОКС, и такое же лечение инсулином показало противоречивые результаты (7). Данные небольших пилотных исследований, умеренных клинических испытаний и метаанализа свидетельствуют о преимуществах инсулинотерапии (1–3,5). С другой стороны, последующие рандомизированные клинические испытания не подтвердили увеличения выживаемости (7, 8). Более того, если двойная антиагрегационная терапия в настоящее время является терапевтической основой для пациентов с ИМпST, получающих ЧКВ (9), то более частая антиагрегационная терапия и явления кровотечения могут снизить их терапевтическую эффективность (11-13). Таким образом, вполне вероятно, что индивидуальный ответ на двойную антиагрегационную терапию и гипергликемический стресс могут влиять на механизмы резистентности и/или приводить к усилению фармакологической функциональной дезактивации микробной флорой. Термин микробиота указывает на совокупность геномов микроорганизмов, которые находятся в экологической нише и составляют «человеческую микробиоту» (14). По анализируемому анатомическому округу говорят о кишечной, глазной, буккальной, вагинальной микробиоте и др. Анализ ДНК микроорганизмов, живущих в желудочно-кишечном тракте человека, проведенный с помощью метагеномных методов консорциумом MetaHIT, идентифицировал более 3 миллионов генов, что в 150 раз больше, чем у человека (16-21). Кроме того, сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертония и ишемическая болезнь сердца, в значительной степени обусловлены присутствием в кишечнике Enterobacteriaceae, Firmicutes и Lattobacilli, что может определять их начало (22). В этом контексте анализ фекальной микробиоты до ЧКВ, при выписке из стационара и при последующем наблюдении можно считать полезным для выявления пациентов с гипергликемией с нарушением метаболически-окислительных процессов и протромботических коррелятов с худшим постпроцедурным прогнозом (23). ). Простота получения образцов фекальной микробиоты и соответствующее влияние на научное сообщество и рутинную клиническую практику подталкивают нас к тому, чтобы настаивать на проведении клинических исследований вместе с геномным, метаболическим и клеточным анализом микробиоты и извлечении как можно большего количества образцов. как можно больше информации у пациентов с гипергликемией и ИМпST. Это исследование никогда не предлагалось в научных исследованиях и клинической практике госпитализированных пациентов с гипергликемией по поводу ИМпST. Действительно, большое количество данных свидетельствует о том, что гипергликемия вызывает усиление окислительного стресса и воспаления как в атеросклеротических бляшках, так и в тромбах, и поэтому она играет центральную роль в определении худших исходов при ИМпST. Таким образом, анализ фекальной микробиоты во время мероприятия теоретически может выявить гипергликемических больных с избыточным воспалительно-оксидативным тонусом, обусловленным гипергликемией, обуславливающим резистентность к двойной антиагрегационной терапии и коронарному стентированию, а также обуславливающий протромботические явления после коронарной реперфузии ЧКВ. Поэтому авторы проведут исследование по анализу микробиоты у пациентов с острым гипергликемическим и нормогликемическим коронарным синдромом.

ЦЕЛИ. Основная цель этого исследования будет состоять в том, чтобы оценить любые изменения в микробиоте и ее активность в фекальном материале, взятом до ЧКВ, а также через 6 и 12 месяцев у пациентов с гипергликемическим ИМпST, а также оценить, могут ли изменения в микробиоте быть связаны к 12-месячному прогнозу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Пациенты Это когортное исследование для изучения влияния возможных изменений микробиоты и ее активности в образцах фекалий, взятых у пациентов с гипергликемическим ИМпST по сравнению с нормогликемическим. Этих пациентов лечат в соответствии с обычными терапевтическими практиками «реальной жизни», принятыми в отделении кардиологии Университета «Луиджи Ванвителли» в Кампании. После выписки из больницы всем пациентам будет предложено провести контрольные визиты, как указано в руководстве по ведению пациентов с ИМпST (6), в отделении кардиологии Университета Кампании «Луиджи Ванвителли» и в VI отделение внутренней медицины Университета Луиджи Ванвителли в Кампании. Все пациенты будут находиться под наблюдением в течение 12 месяцев после события в качестве последующего наблюдения. Согласно недавнему определению Американской кардиологической ассоциации, гипергликемия будет определяться уровнем гликемии крови натощак > 140 мг/дл (1, 9). Все пациенты с появлением симптомов в течение 12 часов и подъемом сегмента ST на 1 мм в 2 или более смежных периферических отведениях или по крайней мере на 2 мм в 2 или более смежных прекардиальных отведениях или впервые возникшей блокадой левой ветви будут рассмотрены для проведения ЧКВ. Критерии включения будут включать: возраст старше 18 лет и госпитализацию по поводу первого эпизода ИМпST. Пациенты с фракцией выброса левого желудочка <25%, с предшествующей ВМА или предшествующим ЧКВ и/или шунтированием будут исключены. Каждый будет включен в исследование после подписания информированного согласия. Рутинный гематологический анализ будет проводиться при поступлении, до проведения медикаментозной терапии и возможного обследования коронарных артерий, а также через 6 и 12 месяцев. В аликвоте образца крови, взятого в это время, мы будем оценивать триметиламин-N-оксид (ТМАО), продукт бактериального метаболизма, повышенный уровень которого в сыворотке крови связан с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями (24). Кроме того, перед ЧКВ, а также через 6 и 12 месяцев будет взята проба кала, на которой впоследствии будет проведен анализ микробиоты. Исследование будет проводиться в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

Процедура В этом исследовании авторы оценят когорту пациентов с ИМпST, поступивших в отделение кардиологии Университета Кампании «Луиджи Ванвителли» и получавших двойную антиагрегационную терапию. Всех пациентов будут лечить в соответствии с предложенными протоколами последних рекомендаций по ИМпST (6). Пациенты будут разделены на две группы: гипергликемические пациенты против нормогликемических, в обеих группах пациентов будет проводиться анализ фекальной микробиоты, до ЧКВ и до двойной антитромбоцитарной терапии. Микробиота будет извлечена из фекального материала, а затем подготовлена ​​и впоследствии проанализирована. В клинической практике невозможно культивировать в лаборатории подавляющее большинство кишечных бактерий по сравнению с огромным количеством присутствующих микроорганизмов. Благодаря самым современным методам секвенирования бактериальной ДНК (Next Generation Sequencing), извлеченной из фекального материала, в настоящее время возможна полная и достоверная идентификация кишечной микробиоты. Помимо определения присутствующих видов бактерий, авторы также могут выразить общую степень здоровья микробиоты (или дисбактериоза), ее эффективность в производстве некоторых полезных или вредных веществ, адекватность микробиоты по отношению к некоторым фундаментальным функциям. к чему является заместителем и склонность самой микробиоты к воспалительным заболеваниям кишечника, нарушениям обмена веществ и старению. Результатом является внушительный объем данных, настоящее удостоверение личности микробиоты, именуемое паспортом микробиоты.

Подготовка проб и анализ. Образцы для секвенирования микробиоты будут собираться из фекального материала и храниться при сверхнизкой температуре (-80°C), чтобы избежать повреждения исходного образца. Секвенирование микробиоты будет выполнено лабораторией микробиологии Университета Кампании «Луиджи Ванвителли». Для секвенирования микробиоты мы будем использовать метод «Секвенирование следующего поколения» (NGS), который позволяет параллельно секвенировать миллионы фрагментов ДНК (25) с помощью оборудования Illumina (Сан-Диего, Калифорния). ДНК будет извлечена из этих образцов с использованием процедуры коммерческого набора с высокой воспроизводимостью (Qiagen, Invitrogen). Окончательный выход и качество выделенной ДНК будут определять с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) и QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Карлсбад, Калифорния). Экстрагированная ДНК будет амплифицирована с помощью ПЦР с праймерами: прямым: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 и обратным: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), которые нацелены на гипервариабельные области V3 и V4 16S. ген рРНК. Каждая ПЦР-амплификация будет проводиться по протоколу подготовки библиотек 16S для метагеномного секвенирования (Illumina, Сан-Диего, Калифорния). Продукты амплификации будут количественно определены с помощью фторидатора Qubit (Invitrogen Co., Карлсбад, Калифорния) и сгруппированы по эквимолярному количеству каждого образца с конечной концентрацией 2 нМ. К образцам будет добавлена ​​библиотека управления Phix (Illumina). Затем сгруппированные образцы будут секвенированы на платформе MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния). Полученные таким образом данные будут подвергаться контролю качества с помощью биоинформатического анализа с FastQC. Наконец, данные будут проанализированы в соответствии со статистическими тестами, предложенными в руководстве по метагеномному секвенированию. Данные пациентов будут сравниваться друг с другом и с течением времени с эталонными базами данных. Оценка эпигенетической активности микробиоты и биохимических дозировок цитокинов и свободных радикалов будет проводиться в лаборатории фармакологии Университета Кампании «Луиджи Ванвителли». В частности, для оценки эпигенетической активности микробиоты каждого отдельного гипергликемического по сравнению с нормогликемическим больным с ИМпST будем действовать по протоколу QIAGEN (Италия) с выделением из фекального материала тотальной РНК, в том числе низкой -масса одной молекулярной (микроРНК). Окончательный выход и качество выделенной РНК будут определять с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA). С помощью qRT-PCR (QIAGEN, Италия) будут определяться уровни экспрессии следующих фекальных микроРНК: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 и miR-663. участвует в регуляции микробиоты кишечника; миР-10а и миР-18b, участвующие в регуляции кишечной микробиоты и метаболического воспаления; миР-106а, миР-17, миР-19а, миР-20а, миР-206, миР-222 и миР-223 участвуют в метаболическом воспалении и передаче сигналов инсулина/ИФР-1 (26). Метаболическая активность микробиоты у каждого отдельного пациента с гипергликемией по сравнению с нормогликемическим пациентом с ИМпST будет оцениваться путем определения короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) в образцах фекалий: уровни КЦЖК в кале, продукта бактериальной ферментации, по-видимому, коррелируют с улучшение при диабете 2 типа (27). Воспалительную активность микробиоты будут оценивать путем определения фекальных уровней ЛПС (28-29), ИЛ-1β и ИЛ-6 (30-32), а окислительную активность - путем анализа фекальных уровней АФК, СОД и ГШ (33-34).

Последующее наблюдение Исследование авторов предназначено для лечения пациентов с гипергликемией по сравнению с нормогликемией с ИМпST в «реальной жизни», без вмешательства жестких правил, которые ограничивают обобщаемость РКИ. Поэтому после выписки из больницы всем пациентам будет предложено провести контрольные визиты, как указано в руководстве по ведению пациентов после ИМпST (6), в отделении кардиологии Университета Кампании «Луиджи Ванвителли». , и в VI отделении внутренних болезней Кампанского университета имени Луиджи Ванвителли. Все пациенты будут находиться под наблюдением в течение 12 месяцев после события в качестве последующего наблюдения для практической клинической оценки (ЭКГ, нагрузочный тест, эхокардиограмма, уровень глюкозы), как указано в рекомендациях по ведению пациентов с ИМпST (6). В эти же сроки будут взяты образцы стула для анализа микробиоты. Кроме того, в управлении и оценке гликемической компенсации в течение 12 месяцев наблюдения врач также будет участвовать для поддержания уровня HbA1c <7%, гликемии от 90 до 140 мг/дл и постпрандиальной гликемии <180 мг. / дл.

Сердечно-сосудистые конечные точки Сердечно-сосудистые конечные точки в обеих группах будут включать повторный инфаркт миокарда, повторную госпитализацию по поводу ишемической болезни сердца (рестеноз, имплантация стента или аорто-коронарное шунтирование), сердечную недостаточность, инсульт, сердечную смертность и все причины смертности. . Первичная комбинированная конечная точка будет состоять из сердечно-сосудистых событий, таких как инфаркт миокарда, госпитализация по поводу сердечной недостаточности, инсульт или сердечная смертность. Вторичной конечной точкой будет оценка сердечной функции: снижение фракции выброса, увеличение объема левого желудочка, снижение коронарной перфузии. Все случаи смерти будут рассмотрены и классифицированы как сердечные (смерть, вызванная ИМА, желудочковыми аритмиями, рефрактерной сердечной недостаточностью) или несердечные. Все реваскуляризации будут классифицироваться как ранние (элективная реваскуляризация в течение 60 дней после коронарографии) или поздние. Только поздние реваскуляризации будут классифицироваться как кардиальные события, поэтому пациенты с ранней плановой реваскуляризацией будут исключены из анализа.

Статистический анализ Две группы будут сравниваться с использованием теста χ2 Пирсона для категориальных переменных и теста Крускала-Уоллиса для непрерывных переменных. Ковариатные кандидаты для включения в многофакторную модель будут идентифицированы путем концентрации на факторах, которые будут значительно различаться (значение P <0,05) в одномерном анализе между гипергликемическими и нормогликемическими пациентами. Регрессия Кокса будет использоваться для построения модели смертности. Коэффициент рисков для смертности будет скорректирован с учетом возраста, ИМТ, холестерина, ЛПНП, триглицеридов и терапии аспирином, тиклопидином, комбинацией антиагрегантов, β-блокаторов, ингибиторов АПФ или сартанов, противодиабетических препаратов, статинов во время госпитализации по поводу ИМпST. Анализ выживаемости в течение первого года после ИМпST будет проводиться с использованием кривой Каплана-Мейера и метода регрессии Кокса. Кривые смертности будут получены отдельно для пациентов с гипергликемией и нормогликемией для сравнения с использованием логарифмического рангового критерия. Все тесты будут считаться значимыми, если значение р<0,05. Все анализы будут проводиться в двух исследуемых популяциях. Анализ «оценки склонности» будет выполняться с использованием «неэкономной» модели логистической регрессии, которая будет сравнивать результаты пациентов с гипергликемией и нормогликемией. В модель будет включено больше переменных, включая возраст, пол, диабет, гипертонию, гиперхолестеринемию, многососудистое заболевание, хроническую почечную недостаточность, поток перед процедурой TIMI, фракцию выброса и успешность процедуры. C-балл указывает на хорошую дискриминацию. На основе «сопоставленных» образцов модель пропорционального риска Кокса будет использоваться для определения влияния гипергликемии и активности микробной флоры на смертность во время последующего наблюдения. SPSS (версия 21, IBM SPSS) будет использоваться для всех анализов.

Размер выборки Размер выборки будет рассчитан на компьютере IBM PC с помощью программного обеспечения GPOWER. Эффект размера будет рассчитываться в соответствии с эпидемиологическими и интервенционными исследованиями, проведенными на пациентах с гипергликемией. Размер выборки, оцениваемый по общему эффекту 25% с ошибкой типа I 0,05 и мощностью 95%, будет составлять 200 участников, 100 для группы, состоящей из пациентов с нормогликемией, и 100 для группы пациентов с гипергликемией.