Analýza mikrobioty a STEMI

Hyperglykémie je častým nálezem u pacientů s diagnostikovaným akutním koronárním syndromem (AKS) a je nezávislým prediktorem mortality u pacientů s diabetem i bez diabetu (1–4). Ačkoli je perkutánní koronární intervence (PCI) základním kamenem infarktu myokardu s elevacemi ST segmentu (STEMI) [4-6], výskyt srdečního selhání, opakovaného infarktu a úmrtí u hyperglykemických pacientů zůstává významný, s mortalitou více než 40 % jeden rok po události (4-5). Ve skutečnosti jsou restenóza a jevy bez reflow častými jevy, které vedou k horším klinickým výsledkům u hyperglykemických pacientů podstupujících primární PCI a mají za následek aterotrombotickou embolizaci, zvýšený oxidační stres a zánět [3-6]. Ve snaze čelit zvyšující se úmrtnosti na hyperglykémii zavedly koronární jednotky inzulinové protokoly k normalizaci krevní glukózy během AKS a stejná léčba inzulinem vykazovala protichůdné výsledky (7). Údaje z malých pilotních studií, z mírných klinických studií a metaanalýzy naznačovaly přínosy inzulínové terapie (1–3,5). Na druhou stranu následné randomizované klinické studie zvýšení přežití nepotvrdily (7, 8) . Pokud je navíc duální antiagregační terapie v současnosti terapeutickým základem pacientů se STEMI léčených PCI (9), může stále častější antiagregační terapie a krvácivé jevy snižovat jejich terapeutickou účinnost (11–13). Proto je pravděpodobné, že individuální odpověď na duální antiagregační terapii a hyperglykemický stres mohou ovlivnit mechanismy rezistence a/nebo vést ke zvýšení farmakologické funkční deaktivace mikrobiotickou flórou. Termín mikrobiota označuje souhrn genomů mikroorganismů, které sídlí v ekologickém výklenku a které tvoří „lidskou mikrobiotu“ (14). Podle analyzovaného anatomického obvodu hovoříme o střevní, oční, bukální, vaginální mikrobiotě atd. Analýza DNA mikroorganismů žijících v lidském střevním traktu, provedená metagenomickými metodami konsorciem MetaHIT, identifikovala více než 3 miliony genů, což je 150krát více než u lidského druhu (16-21). Kromě toho jsou kardiovaskulární onemocnění, jako je hypertenze a onemocnění koronárních tepen, silně podmíněna přítomností Enterobacteriaceae, Firmicutes a Lattobacilli ve střevě, které mohou určovat jejich nástup (22). V této souvislosti by mohla být analýza fekální mikroflóry před PCI, při propuštění z nemocnice a při sledování považována za užitečnou pro identifikaci hyperglykemických pacientů s alterací metabolicko-oxidačních procesů a protrombotických korelací s horší postprocedurální prognózou (23 ). Snadné získávání vzorků fekální mikroflóry a relevantní dopad na vědeckou komunitu a na rutinní klinickou praxi nás nutí trvat na klinickém výzkumu spolu s genomickou, metabolickou a buněčnou analýzou mikrobioty a extrahovat co nejvíce co nejvíce informací u hyperglykemických pacientů se STEMI. Toto vyšetření nebylo nikdy navrženo ve vědeckém výzkumu a klinické praxi hospitalizovaných pacientů s hyperglykemií pro STEMI. Velké množství důkazů skutečně naznačuje, že hyperglykémie způsobuje rostoucí produkci oxidačního stresu a zánětu, a to jak v aterosklerotickém plátu, tak v trombu, a proto hraje ústřední roli při určování horších výsledků u STEMI. Analýza fekální mikroflóry během příhody by tedy teoreticky mohla identifikovat hyperglykemické pacienty s nadměrným zánětlivým a oxidativním tonusem způsobeným hyperglykémií, kondicionační rezistencí na dvojitou antiagregační terapii a koronární stenting a kondicionačními protrombotickými jevy po koronární reperfuzi pomocí PCI. Autoři proto provedou studii k analýze mikrobioty u pacientů s akutním hyperglykemickým a normoglykemickým koronárním syndromem.

CÍLE Primárním cílem této studie bude zhodnotit jakékoli změny v mikrobiotě a její aktivitě na fekální materiál odebraný před PCI a po 6 a 12 měsících u pacientů s hyperglykemickým STEMI a také zhodnotit, zda změny v mikrobiotě mohou souviset do 12měsíční prognózy.

MATERIÁLY A METODY Pacienti Toto je kohortová studie zkoumající účinky možných změn v mikrobiotě a její aktivitě ve vzorcích stolice odebraných pacientům s hyperglykemickým STEMI v/s normoglykemickým. Tito pacienti jsou léčeni podle rutinních „skutečných“ terapeutických postupů přijatých na kardiologickém oddělení Univerzity „Luigi Vanvitelli“ v Kampánii. Po propuštění z nemocnice budou všichni pacienti pozváni, aby provedli kontrolní návštěvy, jak naznačují pokyny pro léčbu pacientů po STEMI (6), na kardiologickém oddělení Univerzity v Kampánii „Luigi Vanvitelli“ a na VI divize vnitřního lékařství na Univerzitě Luigiho Vanvitelliho v Kampánii. Všichni pacienti budou sledováni po dobu 12 měsíců po události jako kontrola. Podle nedávné definice American Heart Association bude hyperglykémie definována hladinami krevní glykémie nalačno > 140 mg/dl (1, 9). Všichni pacienti s nástupem příznaků do 12 hodin a 1 mm elevací ST segmentu ve 2 nebo více sousedících periferních svodech nebo alespoň 2 mm u 2 nebo více sousedících prekordiálních svodů nebo nově vzniklý blok levé větve budou zvažováni pro PCI. Kritéria pro zařazení budou zahrnovat: věk nad 18 let a přijetí pro první epizodu STEMI. Pacienti s ejekční frakcí levé komory <25 %, s předchozí IMA nebo předchozí PCI a/nebo by-passem budou vyloučeni. Každý bude zařazen do studie po podpisu informovaného souhlasu. Rutinní hematologický rozbor bude proveden při přejímce, před nácvikem lékařské terapie a případného vyšetření koronárních tepen a po 6 a 12 měsících. Na alikvotu krevního vzorku odebraného v těchto časech vyhodnotíme trimethylamin-N-oxid (TMAO), produkt bakteriálního metabolismu, jehož zvýšené sérové ​​hladiny jsou spojeny s nežádoucími kardiovaskulárními příhodami (24). Kromě toho bude před PCI a 6 a 12 měsíců poté odebrán vzorek stolice, na kterém bude následně analyzována mikroflóra. Výzkum bude veden v souladu se zásadami Helsinské deklarace.

Postup V této studii autoři zhodnotí kohortu pacientů se STEMI přijatých do Kardiologického oddělení Univerzity „Luigi Vanvitelli“ v Kampánii a léčených duální antiagregační terapií. Všichni pacienti budou léčeni podle navržených protokolů nejnovějších doporučení pro STEMI (6). Pacienti budou rozděleni do dvou skupin: hyperglykemičtí v/s normoglykemičtí, u obou skupin pacientů bude provedena analýza fekální mikrobioty, pre PCI a preduální antiagregační terapie. Mikrobiota bude extrahována z fekálního materiálu a následně připravena a následně analyzována. V klinické praxi není možné kultivovat v laboratoři naprostou většinu střevních bakterií ve srovnání s obrovským množstvím přítomných mikroorganismů. Díky nejmodernějším technikám sekvenování bakteriální DNA (Next Generation Sequencing) extrahované z fekálního materiálu je nyní možná úplná a spolehlivá identifikace střevní mikroflóry. Kromě identifikace přítomných bakteriálních druhů jsou autoři schopni vyjádřit i celkový zdravotní stupeň mikrobioty (resp. dysbiózy), její účinnost v produkci některých užitečných či škodlivých látek, přiměřenost mikroflóry s ohledem na některé základní funkce. ke kterému je zástupcem a sklonem samotné mikrobioty proti zánětlivým onemocněním střev, metabolickým onemocněním a stárnutí. Výsledkem je působivé množství dat, skutečný průkaz totožnosti mikrobioty, pojmenovaný Microbiota pas.

Příprava a analýza vzorků. Vzorky pro sekvenování mikroflóry budou odebírány z fekálního materiálu a skladovány při velmi nízké teplotě (-80 °C), aby nedošlo k poškození původního vzorku. Sekvenování mikrobioty bude provedeno laboratoří mikrobiologie University of Campania "Luigi Vanvitelli". Pro sekvenování mikroflóry použijeme metodu „NextGeneration Sequencing“ (NGS), která umožňuje paralelní sekvenování milionů fragmentů DNA (25) pomocí zařízení Illumina (San Diego, CA). DNA bude z těchto vzorků extrahována pomocí vysoce reprodukovatelného postupu komerční soupravy (Qiagen, Invitrogen). Konečný výtěžek a kvalita extrahované DNA bude stanovena pomocí spektrofotometru NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) a QubitFluorometru 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Extrahovaná DNA bude amplifikována pomocí PCR s primery: forward: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 'a reverse: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), které cílí na hypervariabilní oblast V3 a V4 16S gen rRNA. Každá PCR amplifikace bude provedena podle protokolu pro přípravu 16S knihoven pro metagenomické sekvenování (Illumina, San Diego, CA). Produkty amplifikace budou kvantifikovány fluoridátorem Qubit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) a seskupeny v ekvimolárním množství každého vzorku s konečnou koncentrací 2 nM. Ke vzorkům bude přidána kontrolní knihovna Phix (Illumina). Seskupené vzorky budou poté sekvenovány na platformě MiSeq (Illumina, San Diego, CA). Takto získaná data budou podrobena kontrole kvality bioinformatickou analýzou s FastQC. Nakonec budou data analyzována podle statistických testů navržených směrnicemi pro metagenomické sekvenování. Údaje o pacientech budou porovnávány mezi sebou a v průběhu času s referenčními databázemi. Hodnocení epigenetické aktivity mikrobioty a biochemických dávek cytokinů a volných radikálů bude provedeno v laboratoři farmakologie Univerzity v Kampánii „Luigi Vanvitelli. Zejména pro hodnocení epigenetické aktivity mikrobioty každého jednotlivého hyperglykemického v/s normoglykemického pacienta se STEMI budeme postupovat podle protokolu QIAGEN (Itálie) s extrakcí z fekálního materiálu celkové RNA, včetně nízké -hmotnost jedné molekuly (mikroRNA). Konečný výtěžek a kvalita extrahované RNA bude stanovena pomocí spektrofotometru NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA). Prostřednictvím qRT-PCR (QIAGEN, Itálie) budou detekovány hladiny exprese následujících fekálních mikroRNA: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 a miR-663 podílí se na regulaci střevní mikroflóry; miR-10a a miR-18b zapojené do regulace střevní mikrobioty a metabolického zánětu; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 a miR-223 se účastní metabolického zánětu a signalizace inzulínu/IGF-1 (26). Metabolická aktivita mikrobioty u každého jednotlivého hyperglykemického v/s normoglykemického pacienta se STEMI bude hodnocena stanovením mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFA) ze vzorků stolice: zdá se, že hladiny fekální SCFA, produktu bakteriální fermentace, korelují s zlepšení diabetu 2. typu (27). Zánětlivá aktivita mikrobioty bude hodnocena stanovením fekálních hladin LPS (28-29), IL-1β a IL-6 (30-32), zatímco oxidační aktivita pomocí analýzy fekálních hladin ROS, SOD a GSH (33-34).

Následná studie autorů je navržena tak, aby zvládala hyperglykemické v/s normoglykemické pacienty se STEMI v „reálném životě“, bez zásahů rigidních pravidel, která omezují generalizovatelnost RCT. Po propuštění z nemocnice budou proto všichni pacienti pozváni, aby provedli kontrolní návštěvy, jak je uvedeno v pokynech pro léčbu pacientů po STEMI (6), na kardiologickém oddělení univerzity v Kampánii „Luigi Vanvitelli“ a na VI. divizi vnitřního lékařství Univerzity "Luigi Vanvitelli" v Kampánii. Všichni pacienti budou sledováni po dobu 12 měsíců po příhodě v rámci sledování, aby se procvičilo klinické hodnocení (EKG, zátěžový test, echokardiogram, hladiny glukózy), jak je uvedeno v pokynech pro léčbu pacientů se STEMI (6). V těchto časových bodech budou také odebrány vzorky stolice pro analýzu mikrobioty. Kromě toho se na řízení a hodnocení glykemické kompenzace během 12 měsíců sledování bude podílet také lékař, aby se udržely hladiny HbA1c <7 %, glykémie mezi 90 a 140 mg/dl a postprandiální glykémie <180 mg / dl.

Kardiovaskulární koncové body Kardiovaskulární koncové body v obou kohortách budou zahrnovat re-infarkt myokardu, rehospitalizaci pro onemocnění koronárních tepen (re-stenóza, implantace stentu nebo aorto-koronární bypass), srdeční selhání, mrtvice, srdeční mortalita a všechny příčiny mortality . Primární složený cílový bod se bude skládat z kardiovaskulárních příhod, jako je infarkt myokardu, hospitalizace pro srdeční selhání, cévní mozková příhoda nebo srdeční mortalita. Sekundární cílový bod bude spočívat ve zhodnocení srdeční funkce: snížení ejekční frakce, zvětšení objemu levé komory, snížení koronární perfuze. Všechna úmrtí budou přezkoumána a klasifikována jako srdeční (smrt způsobená IMA, ventrikulární arytmie, refrakterní srdeční selhání) nebo nekardiální. Všechny revaskularizace budou klasifikovány jako časné (elektivní revaskularizace do 60 dnů po koronarografii) nebo pozdní. Pouze pozdní revaskularizace budou klasifikovány jako srdeční příhody, takže pacienti s časnou elektivní revaskularizací budou z analýzy vyloučeni.

Statistická analýza Obě skupiny budou porovnány pomocí Pearsonova χ2 testu pro kategorické proměnné a Kruskal-Wallisova testu pro spojité proměnné. Kovariátní kandidáti pro vstup do multivariabilního modelu budou identifikováni soustředěním se na faktory, které se budou významně lišit (P hodnota <0,05) v univariační analýze mezi hyperglykemickými v/s normoglykemickými pacienty. K sestavení modelu úmrtnosti bude použita Coxova regrese. Poměr rizik pro mortalitu bude během hospitalizace pro STEMI upraven podle věku, BMI, cholesterolu, LDL, triglyceridů a aspirinové terapie, tiklopidinu, kombinace antiagregancií, β-blokátorů, ACE inhibitorů nebo sartanů, antidiabetik, statinů. Analýza přežití během prvního roku od STEMI bude provedena pomocí Kaplan-Meierovy křivky a Coxovy regresní metody. Křivky úmrtnosti budou získány samostatně pro hyperglykemické pacienty v/s normoglykemie, které budou porovnány pomocí log-rank testu. Všechny testy budou považovány za významné, pokud p hodnota <0,05. Všechny analýzy budou provedeny ve dvou studovaných populacích. Analýza "propensity score" bude provedena pomocí "nešetrného" logistického regresního modelu, který bude porovnávat výsledky hyperglykemických v/s normoglykemických pacientů. Do modelu bude zahrnuto více proměnných včetně věku, pohlaví, diabetu, hypertenze, hypercholesterolemie, onemocnění více cév, chronického selhání ledvin, průtoku TIMI před výkonem, ejekční frakce a úspěšnosti procedury. C-skóre bude indikovat dobrou diskriminaci. Na základě „spárovaných“ vzorků bude Coxův model proporcionálního rizika použit ke stanovení vlivu hyperglykémie a aktivity mikrobiotické flóry na mortalitu během sledování. Pro všechny analýzy bude použit SPSS (verze 21, IBM SPSS).

Velikost vzorku Velikost vzorku bude vypočítána na počítači IBM PC pomocí softwaru GPOWER. Velikostní efekt bude vypočítán podle epidemiologických a intervenčních studií provedených u hyperglykemických pacientů. Velikost vzorku odhadnutá na globální efekt 25 % s chybou I. typu 0,05 a sílou 95 % bude 200 účastníků, 100 pro skupinu složenou z normoglykemických pacientů a 100 pro skupinu hyperglykemických pacientů.