Analyse av mikrobiota og STEMI

Hyperglykemi er et vanlig funn hos pasienter diagnostisert med akutt koronarsyndrom (ACS) og er en uavhengig prediktor for dødelighet hos pasienter med og uten diabetes (1-4). Selv om perkutan koronar intervensjon (PCI) er hjørnesteinen i ST-segment elevation myokardinfarkt (STEMI) (4-6), er forekomsten av hjertesvikt, re-infarkt og død hos hyperglykemiske pasienter fortsatt betydelig, med en dødelighet på mer enn 40 % ett år etter hendelsen (4-5). Faktisk er restenose og ikke-reflow-fenomener vanlige hendelser som fører til dårligere kliniske utfall, hos hyperglykemiske pasienter som gjennomgår primær PCI, og som resulterer i aterotrombotisk embolisering, økt oksidativt stress og betennelse (3-6). I et forsøk på å motvirke økningen i dødelighet fra hyperglykemi, implementerte koronarenhetene insulinprotokoller for å normalisere blodsukkeret under ACS, og den samme insulinbehandlingen viste motstridende resultater (7). Data fra små pilotstudier, fra moderate kliniske studier og en metaanalyse antydet fordeler ved insulinbehandling (1-3,5). På den annen side har påfølgende randomiserte kliniske studier ikke bekreftet en økning i overlevelse (7, 8). Videre, hvis den doble anti-aggregeringsterapien for tiden er det terapeutiske grunnlaget for pasienter med STEMI behandlet med PCI (9), kan stadig hyppigere anti-aggregeringsterapi og blødningsfenomener redusere deres terapeutiske effekt (11-13). Derfor er det sannsynlig at den individuelle responsen på den doble anti-aggregeringsterapien, og det hyperglykemiske stresset, kan påvirke resistensmekanismer og/eller føre til en økning i farmakologisk funksjonell deaktivering av den mikrobiotiske floraen. Begrepet mikrobiota indikerer helheten av genomene til mikroorganismer som befinner seg i en økologisk nisje, og som utgjør den «menneskelige mikrobiota» (14). I henhold til det analyserte anatomiske distriktet snakker vi om intestinal, okulær, bukkal, vaginal mikrobiota, etc. DNA-analysen av mikroorganismer som lever i menneskets tarmkanal, realisert med metagenomiske metoder av MetaHIT-konsortiet, har identifisert over 3 millioner gener, 150 ganger de fra menneskearten (16-21). I tillegg er kardiovaskulære sykdommer som hypertensjon og koronarsykdom sterkt betinget av tilstedeværelsen av Enterobacteriaceae, Firmicutes og Lattobacilli i tarmen, som kan bestemme utbruddet (22). I denne sammenhengen kan analysen av avføringsmikrobiotaen før PCI, ved utskrivning fra sykehus og ved oppfølging anses som nyttig for å identifisere hyperglykemiske pasienter med endring av metabolske-oksidative prosesser, og pro-trombotiske korrelater med dårligere postprosedyreprognose ( 23 ). Enkelheten av å skaffe prøver av avføringsmikrobiota, og den relevante innvirkningen på det vitenskapelige samfunnet og på rutinemessig klinisk praksis, presser oss til å insistere på klinisk forskning, sammen med en genomisk, metabolsk og cellulær analyse av mikrobiotaen, og å trekke ut så mye informasjon som mulig hos hyperglykemiske pasienter med STEMI. Denne undersøkelsen har aldri blitt foreslått i vitenskapelig forskning og klinisk praksis av innlagte hyperglykemiske pasienter for STEMI. Faktisk tyder en stor mengde bevis på at hyperglykemi forårsaker en økende produksjon av oksidativt stress og betennelse, både i aterosklerotisk plakk og i tromben, og derfor spiller det en sentral rolle i å bestemme verre utfall i STEMI. Derfor kan analysen av fekal mikrobiota under hendelsen teoretisk identifisere hyperglykemiske pasienter med overdreven inflammatorisk og oksidativ tonus forårsaket av hyperglykemi, kondisjoneringsresistens mot dobbel anti-aggregeringsterapi og koronar stenting, og kondisjonering av protrombotiske fenomener etter koronar reperfusjon ved PCI. Derfor vil forfatterne gjennomføre en studie for å analysere mikrobiotaen hos pasienter med akutt hyperglykemisk og normoglykemisk koronarsyndrom.

MÅL Hovedmålet med denne studien vil være å evaluere eventuelle endringer i mikrobiotaen og dens aktivitet på fekalt materiale tatt før PCI, og etter 6 og 12 måneder hos pasienter med hyperglykemisk STEMI, og også evaluere om endringene i mikrobiotaen kan relateres til 12-måneders prognose.

MATERIALER OG METODER Pasienter Dette er en kohortstudie for å undersøke effekten av mulige endringer i mikrobiotaen og dens aktivitet i avføringsprøver tatt fra pasienter med hyperglykemisk STEMI v/s normoglykemisk. Disse pasientene blir behandlet i henhold til rutinemessige "virkelige" terapeutiske praksiser, tatt i bruk ved kardiologiavdelingen ved "Luigi Vanvitelli" University of Campania. Etter utskrivning fra sykehuset vil alle pasienter bli invitert til å gjennomføre kontrollbesøkene, som angitt av retningslinjene for behandling av post-STEMI-pasienter (6), ved kardiologisk avdeling ved University of Campania "Luigi Vanvitelli" og kl. VI-avdelingen for indremedisin ved" Luigi Vanvitelli "University of Campania. Alle pasienter vil bli overvåket i 12 måneder etter hendelsen, som en oppfølging. I henhold til den nylige definisjonen av American Heart Association vil hyperglykemi defineres ved fastende blodglykemiske nivåer > 140 mg/dl (1, 9). Alle pasienter med symptomdebut innen 12 timer og 1 mm forhøyelse av ST-segmentet i 2 eller flere sammenhengende perifere ledninger eller minst 2 mm i 2 eller flere sammenhengende prekordiale ledninger eller ny innsettende venstre grenblokk vil bli vurdert for PCI. Inklusjonskriterier vil inkludere: alder over 18 og opptak til STEMI første episode. Pasienter med venstre ventrikkel ejeksjonsfraksjon <25 %, med tidligere IMA eller tidligere PCI og/eller bypass vil bli ekskludert. Hver av dem vil bli inkludert i studien etter å ha signert et informert samtykke. Rutinemessig hematologisk analyse vil bli utført på tidspunktet for aksept, før praktisering av medisinsk terapi og eventuell koronararterieundersøkelse og etter 6 og 12 måneder. På en alikvot av blodprøven tatt på disse tidspunktene, vil vi evaluere trimetylamin-N-oksid (TMAO), et produkt av bakteriell metabolisme, hvis forhøyede serumnivåer er assosiert med uønskede kardiovaskulære hendelser (24). I tillegg vil det før PCI, og 6 og 12 måneder senere, tas en avføringsprøve som mikrobiotaen skal analyseres på. Forskningen vil bli utført i samsvar med prinsippene i Helsingfors-erklæringen.

Prosedyre I denne studien vil forfatterne evaluere en kohort av pasienter med STEMI innlagt ved kardiologiavdelingen ved "Luigi Vanvitelli" University of Campania, og behandlet med dobbel anti-aggregerende terapi. Alle pasienter vil bli behandlet i henhold til de foreslåtte protokollene i de siste retningslinjene for STEMI (6). Pasienter vil bli klassifisert i to grupper: hyperglykemiske pasienter v/s normoglykemiske, i begge gruppene av pasienter vil det bli utført analyse av fekal mikrobiota, pre-PCI og pre-dobbelt blodplatehemmende terapi. Mikrobiotaen vil bli ekstrahert fra fekalt materiale, og deretter preparert og deretter analysert. Det er ikke mulig i klinisk praksis å dyrke de aller fleste tarmbakterier i laboratoriet, sammenlignet med den enorme mengden mikroorganismer som finnes. Takket være de mest oppdaterte teknikkene for sekvensering av bakterie-DNA (Next Generation Sequencing) ekstrahert fra fekalt materiale, er det nå mulig en fullstendig og pålitelig identifikasjon av tarmmikrobiotaen. I tillegg til å identifisere bakteriearten som er tilstede, er forfattere også i stand til å uttrykke en generell helsegrad av mikrobiotaen (eller dysbiosen), dens effektivitet i produksjonen av noen nyttige eller skadelige stoffer, mikrobiotaens tilstrekkelighet med hensyn til noen grunnleggende funksjoner som er en stedfortreder og tilbøyeligheten til mikrobiotaen selv mot inflammatoriske tarmsykdommer, metabolske sykdommer og aldring. Resultatet er en imponerende mengde data, et ekte identitetskort for mikrobiotaen, kalt Microbiota-passet.

Prøveforberedelse og analyse. Prøver for sekvensering av mikrobiotaen vil bli samlet inn fra fekalt materiale og lagret ved ultralav temperatur (-80°C) for å unngå skade på den originale prøven. Sekvenseringen av mikrobiotaen vil bli utført av laboratoriet for mikrobiologi ved University of Campania "Luigi Vanvitelli". For sekvensering av mikrobiotaen vil vi bruke "NextGeneration Sequencing" (NGS)-metoden, som tillater parallell sekvensering av millioner av DNA-fragmenter (25) gjennom bruk av Illumina-maskineri (San Diego, CA). DNA-et vil bli ekstrahert fra disse prøvene ved å bruke en kommersiell settprosedyre med høy reproduserbarhet (Qiagen, Invitrogen). Det endelige utbyttet og kvaliteten på det ekstraherte DNAet vil bli bestemt ved å bruke NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA) og QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Det ekstraherte DNAet vil bli amplifisert ved PCR med primerne: fremover: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 'og omvendt: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), som er målrettet mot den hypervariable regionen V3 og V4 i 16S. rRNA-genet. Hver PCR-amplifikasjon vil bli utført etter protokoll for klargjøring av 16S-biblioteker for metagenomisk sekvensering (Illumina, San Diego, CA). Amplifikasjonsproduktene vil bli kvantifisert av Qubit fluoridator (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) og gruppert i en ekvimolar mengde av hver prøve med en sluttkonsentrasjon på 2nM. Et Phix-kontrollbibliotek (Illumina) vil bli lagt til prøvene. De grupperte prøvene vil deretter bli sekvensert på MiSeq-plattformen (Illumina, San Diego, CA). Dataene som oppnås på denne måten vil bli gjenstand for kvalitetskontroller ved bioinformatikkanalyse med FastQC. Til slutt vil dataene bli analysert i henhold til de statistiske testene foreslått av retningslinjene for metagenomisk sekvensering. Pasientdata vil bli sammenlignet med hverandre og over tid med referansedatabaser. Evalueringen av den epigenetiske aktiviteten til mikrobiotaen og de biokjemiske dosene av cytokiner og frie radikaler vil bli utført ved laboratoriet for farmakologi ved University of Campania "Luigi Vanvitelli. Spesielt for evaluering av den epigenetiske aktiviteten til mikrobiotaen til hver enkelt hyperglykemisk v/s normoglykemisk pasient med STEMI, vil vi fortsette i henhold til protokollen QIAGEN (Italia) med ekstraksjon fra fekalt materiale av det totale RNA, inkludert det lave -vekt ett molekyl (mikroRNA). Det endelige utbyttet og kvaliteten på det ekstraherte RNA vil bli bestemt ved hjelp av NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA). Gjennom qRT-PCR (QIAGEN, Italia) vil ekspresjonsnivåene til følgende fekale mikroRNA-er bli oppdaget: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 og miR-663 involvert i reguleringen av tarmmikrobiotaen; miR-10a og miR-18b involvert i reguleringen av tarmmikrobiota og metabolsk betennelse; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 og miR-223 involvert i metabolsk betennelse og signalisering av insulin/IGF-1 (26). Den metabolske aktiviteten til mikrobiotaen hos hver enkelt hyperglykemisk v/s normoglykemisk pasient med STEMI vil bli evaluert ved bestemmelse av kortkjedede fettsyrer (SCFA) fra fekale prøver: nivåene av fekal SCFA, et produkt av bakteriell fermentering, ser ut til å korrelere med en bedring i type 2 diabetes (27). Den inflammatoriske aktiviteten til mikrobiotaen vil bli evaluert ved å bestemme fekale nivåer av LPS (28-29), IL-1β og IL-6 (30-32), mens den oksidative aktiviteten gjennom analyse av fekale nivåer av ROS, SOD og GSH (33-34).

Oppfølging Forfatternes studie er designet for å håndtere hyperglykemiske v/s normoglykemiske pasienter med STEMI i det "virkelige liv", uten innblanding fra de rigide reglene som begrenser generaliserbarheten til RCT. Derfor, etter utskrivning fra sykehuset, vil alle pasienter bli invitert til å gjennomføre kontrollbesøkene, som angitt av retningslinjene for behandling av post-STEMI-pasienter (6), ved kardiologisk avdeling ved University of Campania "Luigi Vanvitelli" , og ved VI-avdelingen for indremedisin ved "Luigi Vanvitelli" University of Campania. Alle pasienter vil bli overvåket i 12 måneder etter hendelsen, som oppfølging, for å praktisere klinisk evaluering (EKG, treningstest, ekkokardiogram, glukosenivåer), som angitt av retningslinjene for behandling av STEMI-pasienter (6). På disse tidspunktene vil det også bli tatt avføringsprøver for analyse av mikrobiotaen. I styringen og vurderingen av den glykemiske kompensasjonen i løpet av de 12 månedene med oppfølging, vil legen også være involvert for å opprettholde HbA1c-nivåer <7 %, glykemi mellom 90 og 140 mg/dl og postprandial glykemi <180 mg / dl.

Kardiovaskulære endepunkter De kardiovaskulære endepunktene i begge kohortene vil inkludere hjerteinfarkt, re-hospitalisering for koronararteriesykdom (re-stenose, stentimplantasjon eller aorto-koronar bypass), hjertesvikt, hjerneslag, hjertedødelighet og alle dødelighetsårsaker . Det primære sammensatte endepunktet vil bestå av kardiovaskulære hendelser, som hjerteinfarkt, sykehusinnleggelse for hjertesvikt, hjerneslag eller hjertedødelighet. Det sekundære endepunktet vil bestå i evaluering av hjertefunksjon: reduksjon av ejeksjonsfraksjon, økning i volum av venstre ventrikkel, reduksjon av koronar perfusjon. Alle dødsfall vil bli vurdert og klassifisert som hjerte (død forårsaket av IMA, ventrikulære arytmier, refraktær hjertesvikt) eller ikke-hjerte. Alle revaskulariseringer vil bli klassifisert som tidlig (elektiv revaskularisering innen 60 dager etter koronar angiografi) eller sen. Bare sene revaskulariseringer vil bli klassifisert som hjertehendelser, så pasienter med tidlig elektiv revaskularisering vil bli ekskludert fra analysen.

Statistisk analyse De to gruppene vil bli sammenlignet med Pearson χ2-testen for kategoriske variabler og Kruskal-Wallis-testen for kontinuerlige variabler. Kovariatkandidatene for inntreden i den multivariable modellen vil bli identifisert ved å konsentrere seg om faktorene de som vil avvike signifikant (P verdi <0,05) i den univariate analysen mellom hyperglykemiske v/s normoglykemiske pasienter. Cox-regresjon vil bli brukt for å bygge dødelighetsmodellen. Hazard Ratio for dødelighet vil bli justert for alder, BMI, kolesterol, LDL, triglyserider og aspirinbehandling, tiklopidin, kombinasjon av antiaggreganter, β-blokkere, ACE-hemmere eller sartaner, antidiabetika, statiner, under sykehusinnleggelse for STEMI. Overlevelsesanalyse gjennom det første året fra STEMI vil bli utført ved bruk av Kaplan-Meier kurve og Cox regresjonsmetode. Dødelighetskurvene vil bli innhentet separat for hyperglykemiske pasienter v/s normoglykemi, for å sammenlignes ved bruk av log-rank test. Alle tester vil bli vurdert som signifikante hvis p-verdi <0,05. Alle analyser vil bli utført i de to studiepopulasjonene. En "tilbøyelighetsscore"-analyse vil bli utført ved å bruke en "ikke-sparsimonious" logistisk regresjonsmodell som vil sammenligne resultatene til de hyperglykemiske v/s normoglykemiske pasientene. Flere variabler vil bli inkludert i modellen, inkludert alder, kjønn, diabetes, hypertensjon, hyperkolesterolemi, multivesselsykdom, kronisk nyresvikt, TIMI pre-prosedyre flow, ejeksjonsfraksjon og prosedyresuksess. C-skåren vil indikere god diskriminering. Basert på de "matchede" prøvene, vil Cox proporsjonal risikomodell bli brukt for å bestemme effekten av hyperglykemi, og av mikrobiotisk floraaktivitet på dødelighet under oppfølging. SPSS (versjon 21, IBM SPSS) vil bli brukt for alle analyser.

Prøvestørrelse Prøvestørrelsen vil bli beregnet med IBM PC-datamaskin av GPOWER-programvare. Størrelseseffekten vil bli beregnet i henhold til epidemiologiske og intervensjonelle studier utført på hyperglykemiske pasienter. Prøvestørrelsen estimert på en global effekt på 25 % med type I feil på 0,05 og en styrke på 95 % vil være 200 deltakere, 100 for gruppen bestående av normoglykemiske pasienter og 100 for gruppen av hyperglykemiske pasienter.