Analyse du Microbiote et STEMI

L'hyperglycémie est une constatation courante chez les patients diagnostiqués avec un syndrome coronarien aigu (SCA) et est un prédicteur indépendant de la mortalité chez les patients avec et sans diabète (1-4). Bien que l'intervention coronarienne percutanée (ICP) soit la pierre angulaire de l'infarctus du myocarde avec élévation du segment ST (STEMI) (4-6), l'incidence de l'insuffisance cardiaque, des récidives d'infarctus et des décès chez les patients hyperglycémiques reste importante, avec une mortalité de plus de 40 ans. % un an après l'événement (4-5). En fait, la resténose et les phénomènes de non-refusion sont des événements courants entraînant de moins bons résultats cliniques chez les patients hyperglycémiques subissant une ICP primaire et entraînant une embolisation athérothrombotique, un stress oxydatif accru et une inflammation (3-6). Pour tenter de contrer l'augmentation de la mortalité due à l'hyperglycémie, les unités coronaires ont mis en place des protocoles d'insuline pour normaliser la glycémie pendant le SCA, et le même traitement à l'insuline a montré des résultats contradictoires (7). Les données de petites études pilotes, d'essais cliniques modérés et d'une méta-analyse suggèrent les avantages de l'insulinothérapie (1-3,5). D'autre part, les essais cliniques randomisés ultérieurs n'ont pas confirmé une augmentation de la survie (7, 8) . De plus, si la bithérapie anti-agrégante constitue actuellement la base thérapeutique des patients STEMI traités par ICP (9), la thérapie anti-agrégante de plus en plus fréquente et les phénomènes hémorragiques, peuvent réduire leur efficacité thérapeutique (11 -13). Il est donc probable que la réponse individuelle à la bithérapie anti-agrégante, et le stress hyperglycémique, puissent influencer les mécanismes de résistance, et/ou conduire à une augmentation de la désactivation fonctionnelle pharmacologique par la flore microbiotique. Le terme microbiote désigne l'ensemble des génomes de micro-organismes qui résident dans une niche écologique, et qui constituent le « microbiote humain » (14). Selon le district anatomique analysé on parle de microbiote intestinal, oculaire, buccal, vaginal, etc. L'analyse de l'ADN des micro-organismes vivant dans le tractus intestinal humain, réalisée avec des méthodes métagénomiques par le consortium MetaHIT, a identifié plus de 3 millions de gènes, 150 fois ceux de l'espèce humaine (16-21). De plus, les maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension et les maladies coronariennes sont fortement conditionnées par la présence d'entérobactéries, de firmicutes et de lattobacilles dans l'intestin, qui peuvent déterminer leur apparition (22). Dans ce contexte, l'analyse du microbiote fécal avant l'ICP, à la sortie de l'hôpital et au suivi, pourrait être considérée comme utile pour identifier les patients hyperglycémiques présentant une altération des processus métaboliques-oxydatifs et des corrélats pro-thrombotiques avec un pronostic post-opératoire plus mauvais ( 23 ). La facilité d'obtention d'échantillons de microbiote fécal, et l'impact pertinent sur la communauté scientifique, et sur la pratique clinique courante, nous poussent à insister sur la recherche clinique, accompagnée d'une analyse génomique, métabolique et cellulaire du microbiote, et d'en extraire autant informations que possible chez les patients hyperglycémiques avec STEMI. Cette investigation n'a jamais été proposée dans la recherche scientifique et la pratique clinique des patients hyperglycémiques hospitalisés pour STEMI. En effet, un grand nombre de preuves suggèrent que l'hyperglycémie provoque une production croissante de stress oxydatif et d'inflammation, à la fois dans la plaque d'athérosclérose et dans le thrombus, et qu'elle joue donc un rôle central dans la détermination des pires résultats du STEMI. Ainsi, l'analyse du microbiote fécal lors de l'événement pourrait théoriquement identifier les patients hyperglycémiques présentant un tonus inflammatoire et oxydatif excessif causé par l'hyperglycémie, conditionnant la résistance à la double thérapie anti-agrégante et au stenting coronaire, et conditionnant les phénomènes pro-thrombotiques après reperfusion coronaire par ICP. Par conséquent, les auteurs mèneront une étude pour analyser le microbiote chez des patients atteints d'un syndrome coronarien aigu hyperglycémique et normoglycémique.

OBJECTIFS L'objectif principal de cette étude sera d'évaluer les modifications du microbiote et son activité sur les matières fécales prélevées avant ICP, et après 6 et 12 mois chez les patients atteints de STEMI hyperglycémique, et également d'évaluer si les modifications du microbiote peuvent être liées au pronostic à 12 mois.

MATERIELS ET METHODES Patients Il s'agit d'une étude de cohorte visant à étudier les effets d'éventuelles modifications du microbiote et de son activité dans des échantillons fécaux prélevés chez des patients atteints de STEMI hyperglycémique v/s normoglycémique. Ces patients sont traités selon les pratiques thérapeutiques de routine "de la vie réelle", adoptées à la Division de cardiologie de l'Université "Luigi Vanvitelli" de Campanie. Après la sortie de l'hôpital, tous les patients seront invités à effectuer les visites de contrôle, comme indiqué par les directives pour la gestion des patients post-STEMI (6), à la division de cardiologie de l'Université de Campanie "Luigi Vanvitelli "et à la Division VI de médecine interne de l'Université " Luigi Vanvitelli " de Campanie. Tous les patients seront surveillés pendant 12 mois après l'événement, à titre de suivi. Selon la récente définition de l'American Heart Association, l'hyperglycémie sera définie par une glycémie à jeun > 140 mg/dl (1, 9). Tous les patients présentant des symptômes d'apparition dans les 12 heures et une élévation de 1 mm du segment ST dans 2 dérivations périphériques contiguës ou plus ou d'au moins 2 mm dans 2 dérivations précordiales contiguës ou plus ou un nouveau bloc de branche gauche seront considérés pour une ICP. Les critères d'inclusion incluront : l'âge de plus de 18 ans et l'admission pour un premier épisode STEMI. Les patients avec une fraction d'éjection ventriculaire gauche < 25 %, avec des antécédents d'IMA ou d'ICP et/ou de pontage seront exclus. Chacun sera inclus dans l'étude après avoir signé un consentement éclairé. Une analyse hématologique de routine sera effectuée au moment de l'acceptation, avant de pratiquer un traitement médical et un éventuel examen des artères coronaires et après 6 et 12 mois. Sur une aliquote de l'échantillon de sang prélevé à ces moments, nous évaluerons le N-oxyde de triméthylamine (TMAO), un produit du métabolisme bactérien, dont les taux sériques élevés sont associés à des événements cardiovasculaires indésirables (24). De plus, avant l'ICP, et 6 et 12 mois plus tard, un échantillon de selles sera prélevé sur lequel le microbiote sera ensuite analysé. La recherche sera menée conformément aux principes de la déclaration d'Helsinki.

Procédure Dans cette étude, les auteurs évalueront une cohorte de patients atteints de STEMI admis à la division de cardiologie de l'Université "Luigi Vanvitelli" de Campanie et traités par double thérapie anti-agrégante. Tous les patients seront traités selon les protocoles suggérés des dernières lignes directrices sur le STEMI (6). Les patients seront classés en deux groupes : patients hyperglycémiques v/s normoglycémiques, dans les deux groupes de patients sera réalisée une analyse du microbiote fécal, pré ICP et pré bithérapie antiplaquettaire. Le microbiote sera extrait des matières fécales, puis préparé puis analysé. Il n'est pas possible en pratique clinique de cultiver en laboratoire la grande majorité des bactéries intestinales, par rapport à l'énorme quantité de micro-organismes présents. Grâce aux techniques les plus modernes de séquençage de l'ADN bactérien (Next Generation Sequencing) extrait de la matière fécale, il est désormais possible une identification complète et fiable du microbiote intestinal. En plus d'identifier les espèces bactériennes présentes, les auteurs sont également capables d'exprimer un degré de santé globale du microbiote (ou dysbiose), son efficacité dans la production de certaines substances utiles ou nocives, l'adéquation du microbiote vis-à-vis de certaines fonctions fondamentales auquel est adjoint et la propension du microbiote lui-même contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les maladies métaboliques et le vieillissement. Le résultat est une quantité impressionnante de données, véritable carte d'identité du microbiote, nommée le Passeport du Microbiote.

Préparation et analyse des échantillons. Les échantillons pour le séquençage du microbiote seront collectés à partir de matières fécales et stockés à très basse température (-80°C) pour éviter d'endommager l'échantillon d'origine. Le séquençage du microbiote sera réalisé par le laboratoire de Microbiologie de l'Université de Campanie "Luigi Vanvitelli". Pour le séquençage du microbiote, nous utiliserons la méthode "NextGeneration Sequencing" (NGS), qui permet le séquençage en parallèle de millions de fragments d'ADN (25) grâce à l'utilisation de la machinerie Illumina (San Diego, CA). L'ADN sera extrait de ces échantillons à l'aide d'une procédure de kit commercial à haute reproductibilité (Qiagen, Invitrogen). Le rendement final et la qualité de l'ADN extrait seront déterminés à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) et du QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). L'ADN extrait sera amplifié par PCR avec les amorces : forward : 5'-CCTACGGGNGCWGCAG-3' et reverse : 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), qui ciblent la région hypervariable V3 et V4 du 16S Gène ARNr. Chaque amplification PCR sera réalisée selon le protocole de préparation de bibliothèques 16S pour le séquençage métagénomique (Illumina, San Diego, CA). Les produits d'amplification seront quantifiés par le fluoridateur Qubit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) et regroupés à une quantité équimolaire de chaque échantillon avec une concentration finale de 2 nM. Une bibliothèque de contrôle Phix (Illumina) sera ajoutée aux échantillons. Les échantillons groupés seront ensuite séquencés sur la plateforme MiSeq (Illumina, San Diego, CA). Les données ainsi obtenues seront soumises à des contrôles de qualité par analyse bioinformatique avec FastQC. Enfin, les données seront analysées selon les tests statistiques suggérés par les guidelines pour le séquençage métagénomique. Les données des patients seront comparées entre elles et dans le temps avec des bases de données de référence. L'évaluation de l'activité épigénétique du microbiote et des dosages biochimiques des cytokines et des radicaux libres sera réalisée au laboratoire de Pharmacologie de l'Université de Campanie "Luigi Vanvitelli. En particulier, pour l'évaluation de l'activité épigénétique du microbiote de chaque patient hyperglycémique v/s normoglycémique avec STEMI, nous procéderons selon le protocole QIAGEN (Italie) à l'extraction à partir de matières fécales de l'ARN total, y compris le faible -poids un moléculaire (microARN). Le rendement final et la qualité de l'ARN extrait seront déterminés à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA). Par qRT-PCR (QIAGEN, Italie), les niveaux d'expression des microARN fécaux suivants seront détectés : miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 et miR-663 impliqué dans la régulation du microbiote intestinal ; miR-10a et miR-18b impliqués dans la régulation du microbiote intestinal et de l'inflammation métabolique ; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 et miR-223 impliqués dans l'inflammation métabolique et la signalisation insuline/IGF-1 (26). L'activité métabolique du microbiote chez chaque patient hyperglycémique v/s normoglycémique avec STEMI sera évaluée par la détermination des acides gras à chaîne courte (AGCC) à partir d'échantillons fécaux : les niveaux d'AGCC fécaux, un produit de la fermentation bactérienne, semblent corrélés avec une amélioration du diabète de type 2 (27). L'activité inflammatoire du microbiote sera évaluée par la détermination des taux fécaux de LPS (28-29), IL-1β et IL-6 (30-32), tandis que l'activité oxydative par l'analyse des taux fécaux de ROS, SOD et GSH (33-34).

L'étude de suivi des auteurs est conçue pour gérer les patients hyperglycémiques vs normoglycémiques avec STEMI dans la "vie réelle", sans interférence des règles rigides qui limitent la généralisabilité des ECR. Par conséquent, après la sortie de l'hôpital, tous les patients seront invités à effectuer les visites de contrôle, comme indiqué par les directives pour la gestion des patients post-STEMI (6), à la Division de cardiologie de l'Université de Campanie "Luigi Vanvitelli" , et à la Division VI de Médecine Interne de l'Université "Luigi Vanvitelli" de Campanie. Tous les patients seront suivis pendant 12 mois après l'événement, à titre de suivi, pour pratiquer l'évaluation clinique (ECG, test d'effort, échocardiogramme, glycémie), comme indiqué par les lignes directrices pour la prise en charge des patients STEMI (6). À ces moments-là, des échantillons de selles seront également prélevés pour l'analyse du microbiote. De plus, dans la gestion et l'évaluation de la compensation glycémique dans les 12 mois de suivi, le médecin sera également impliqué afin de maintenir des taux d'HbA1c < 7 %, une glycémie entre 90 et 140 mg/dl et une glycémie postprandiale < 180 mg /dl.

Critères d'évaluation cardiovasculaires Les critères d'évaluation cardiovasculaires dans les deux cohortes comprendront le ré-infarctus du myocarde, la réhospitalisation pour maladie coronarienne (resténose, implantation de stent ou pontage aorto-coronaire), l'insuffisance cardiaque, l'accident vasculaire cérébral, la mortalité cardiaque et toutes les causes de mortalité. . Le critère d'évaluation composite principal consistera en des événements cardiovasculaires, tels qu'un infarctus du myocarde, une hospitalisation pour insuffisance cardiaque, un accident vasculaire cérébral ou une mortalité cardiaque. Le critère secondaire consistera en l'évaluation de la fonction cardiaque : diminution de la fraction d'éjection, augmentation du volume du ventricule gauche, diminution de la perfusion coronarienne. Tous les décès seront examinés et classés comme cardiaques (décès causés par IMA, arythmies ventriculaires, insuffisance cardiaque réfractaire) ou non cardiaques. Toutes les revascularisations seront classées comme précoces (revascularisation élective dans les 60 jours suivant la coronarographie) ou tardives. Seules les revascularisations tardives seront classées comme événements cardiaques, de sorte que les patients ayant subi une revascularisation élective précoce seront exclus de l'analyse.

Analyse statistique Les deux groupes seront comparés à l'aide du test de Pearson χ2 pour les variables catégorielles et du test de Kruskal-Wallis pour les variables continues. Les covariables candidates à l'entrée dans le modèle multivariable seront identifiées en se concentrant sur les facteurs ceux qui différeront significativement (P value <0,05) dans l'analyse univariée entre patients hyperglycémiques vs normoglycémiques. La régression de Cox sera utilisée pour construire le modèle de mortalité. Le Hazard Ratio de mortalité sera ajusté en fonction de l'âge, de l'IMC, du cholestérol, des LDL, des triglycérides et de l'aspirine, de la ticlopidine, de l'association d'anti-agrégants, de β-bloquants, d'inhibiteurs de l'ECA ou de sartans, d'antidiabétiques, de statines, lors d'une hospitalisation pour STEMI. L'analyse de survie au cours de la première année du STEMI sera effectuée à l'aide de la courbe de Kaplan-Meier et de la méthode de régression de Cox. Les courbes de mortalité seront obtenues séparément pour les patients hyperglycémiques vs normoglycémie, à comparer à l'aide du test du log-rank. Tous les tests seront considérés comme significatifs si la valeur p <0,05. Toutes les analyses seront effectuées dans les deux populations étudiées. Une analyse "score de propension" sera réalisée à l'aide d'un modèle de régression logistique "non parcimonieux" qui comparera les résultats des patients hyperglycémiques v/s normoglycémiques. D'autres variables seront incluses dans le modèle, notamment l'âge, le sexe, le diabète, l'hypertension, l'hypercholestérolémie, la maladie multivasculaire, l'insuffisance rénale chronique, le flux avant la procédure TIMI, la fraction d'éjection et le succès de la procédure. Le score C indiquera une bonne discrimination. Sur la base des échantillons "appariés", le modèle de risque proportionnel de Cox sera utilisé pour déterminer l'impact de l'hyperglycémie et de l'activité de la flore microbiotique sur la mortalité au cours du suivi. SPSS (version 21, IBM SPSS) sera utilisé pour toutes les analyses.

Taille de l'échantillon La taille de l'échantillon sera calculée avec un ordinateur IBM PC par le logiciel GPOWER. L'effet de taille sera calculé en fonction des études épidémiologiques et interventionnelles réalisées sur des patients hyperglycémiques. La taille de l'échantillon estimée sur un effet global de 25% avec une erreur de type I de 0,05 et une puissance de 95% sera de 200 participants, 100 pour le groupe composé de patients normoglycémiques et 100 pour le groupe de patients hyperglycémiques.